炭疽中性蛋白酶部分片段的重组表达、纯化及免疫效果研究.pdf
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1、收稿日期:!“#$%“$%?: 检测 重组蛋白的免疫原性。以 2 (A) -为佐剂皮下注射免疫 B2CBD E 小鼠,用 4CFG2 方法测血清总 FHI 水平,J11 比色法测定 脾 1 淋巴细胞增殖,采用流式分选法对脾 1 淋巴细胞亚群分类;789:8;?: 显示重组蛋白具有免疫原性,;* 免疫 B2CBD E 小鼠后,4CFG2 检测到免疫鼠体内有特异性抗体产生;1 淋巴细胞亚群试验表明,重组 * 蛋白以诱发 1K! 型免疫反应为 主;J11 试验表明,;* 蛋白对小鼠脾细胞在体外有促进生长和增殖能力,说明该重组蛋白具有生物学活性。纯化的 ;* 可 诱导高水平的抗体反应,为进一步的功能研
2、究奠定了基础。 关键词 :炭疽杆菌;中性蛋白酶;蛋白表达;纯化 中图分类号:0-L!) L文献标识码:2文章编号:%“%$!(?:8598, *.0) 。根据已有文献报道,中性蛋白酶都有一段 十分保守的氨基酸序列,位于 !(+ , #-! 氨基酸 (B2-(!) ,中性蛋白酶的酶活性主要由这段区域决 定。为进一步研究中性蛋白酶的功能,将炭疽中性 蛋白酶部分片段克隆到原核表达载体 341$!+5 ( 6 ) 中,构建重组表达质粒 341$!+5$*,获得了表达的 蛋白,并对其免疫原性进行了观察,为下一步的功 能研究打下良好基础。 !“ 材料与方法 !#!“ 菌株、载体质粒及试剂M炭疽杆菌株 2%
3、0 株由本所菌种库提供。菌株 !“ #$%?=89: S*2 .?VW8;598 酶、Q*1.、限制性内切酶 B5WA F、G5E F 及 1( S*2 连接酶购自大连宝生物 公司。S*2 快速回收试剂盒、羊抗兔的酶标二抗 购自博大泰克公司。3I4J$1 载体为 .;?W8H5 公司 产品。荧光标记的 /S-、/S( 和 /S+ 分子购自美 国 4B 公司。 !#$“ 引物设计及 %, 4 双酶切 鉴定后,送上海博亚生物公司进行 758 测序。 !“#$ 蛋白纯化及鉴定? 选用 )/;$ ,A+B;-CD E 3B F G 预装柱,以 8H)8 I!J“ 蛋白纯化分析仪进行纯 化。以 =/.;
4、KL./K 法测蛋白浓度。以 $ 转化的 菌株诱导表达蛋白作为阴性对照 =.(#;K 电转移仪 上以半干胶转移法转移各蛋白条带至硝酸纤维素膜 上,GMEN的酪蛋白封闭过夜。以 /5 免疫小鼠血清为 一抗,#! 标记兔抗鼠 4D% 为二抗,78= 显色。 !“%$免疫动物?选用 O P : 周龄的 =8J=Q , 小鼠 GR 只,由军事医学科学院动物中心提供。试验分 /5 免疫组和 !=0 对照组, 每组各 E 只, 以 8B (S) T为佐剂,每次 ER !DQ 只,皮下多点免疫, 间隔 G6 K,共 T 次。 !“ 为酶标二抗,其余同上 , 4 双酶切 结果显示,$(5 酶切为大小正确的 $
5、 载体和 5 片段 (图 G=) 。 图 !$ , 片段的 )*+ 扩增和酶切鉴定结果 :7J9RRR ;/+/ ;8:GM 5 基因 !“# 扩增产物;=:GM =;3 4 和 0;, 4 双酶切 $(5 结果 (“($ -, 的诱导表达和 ./01/-2 3451 鉴定结果? 将 转化重组表达质粒 $(5 和转化载体质粒 $ 的菌株同时经 4!)% 诱导,070(!8%(5 与转化载体质 粒 $ 的菌株相比在 TG FGRT(/) 附近处出现 额外的条带 (图 98)。并且随着 4!)% 的浓度和诱 导温度变化表达没有明显差异。经 +2-+/C B.- 检 测 TG FGRT(/) 附近出
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