热应激对大鼠TNF-α性发热及下丘脑中CAMP含量的影响.pdf
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1、论 著 热应激对大鼠 TNF-性发热及下丘脑中 cAMP 含量的影响 刘利丹, 李 妍, 吴晓岚, 曹 宇, 赵书芬 (中国医科大学基础医学院生理学教研室, 沈阳 110001) 收稿日期: 2005 -01 -15, 修回日期: 2005 -03 -14 基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (No 30270198) 作者简介: 刘利丹 (1978 - ) , 女, 硕士, 研究方向: 体温调节, Tel: 024- 23256666-5301, E-mail: liulidan1978126. com; 赵书芬 (1946 - ) , 女, 教授, 硕士生导师; 曹 宇 (1963 -
2、) , 女, 教授, 博士生导师, 研究方向: 温热 生理, 通讯作者, Tel: 024-23256666-5301, E-mail: caoy5955 sina. com 中国 图 书 分 类 号:R-332;R 318. 03;R 329. 24;R 341; R 342. 4; R 364. 6; R 977. 6 文献标识码: A 文章编号: 1001 -1978 (2005) 09 -1054 -04 摘要: 目的 观察热应激对大鼠 TNF- 性发热效应及下丘 脑中 cAMP 含量的影响。方法 确定热应激后下丘脑 HSP70 表达的高峰时间; 观察热应激后大鼠 TNF- 性发 热效
3、应及下丘脑 cAMP 含量的变化。结果 下丘脑中 HSP70 表达在热应激后12 h 达高峰值, 热应激后可见 TNF- 性发热幅度降低, 同时抑制下丘脑中 cAMP 的含量。结论 热应激能够减弱大鼠 TNF- 性发热效应, 且此作用很可能 是通过高表达的 HSP70 来抑制下丘脑中 cAMP 的升高而实 现的。 关键词: 热应激; 热休克蛋白 70; 肿瘤坏死因子-; 环磷酸腺 苷酸; 发热 生物体在生理或病理情况下致体温升高时通常 不会超过一定高度 (41) , 此现象称为热限。目前 的研究显示, 体内存在有内源性解热物质如精氨酸 加压素 (Arginine vasopressin, AV
4、P) 和 -黑色素细胞 刺激素 (-melanocyte stimulating hormone, -MSH) 等, 但有关热限的生物学机制还有许多不明之处。 当组织、 细胞或机体暴露于高温时, 温热刺激能 够诱导细胞产生热休克蛋白质 (Heat shock proteins, HSPs) , 此过程称为热休克应答 (Heat shock reac- tion, HSR) 1。大量研究证明 HSP70 在细胞保护、 炎症反应和自身免疫等生理病理过程中起重要作 用 2, 3。 本实验观察通过热应激诱导 HSP70 表达对肿 瘤坏死因子 (Tumor necrosis factor-, TNF-)
5、 性发 热的影响, 并检测下丘脑中环磷酸腺苷酸 (Cyclic AMP, cAMP) 含量的变化情况, 以探索 HSP70 是否 参与热限作用及可能的机制。 1 材料与方法 1. 1 实验动物与分组 健康) SD 大鼠, 体重 200 250 g, 由中国医科大学实验动物中心提供, 室温 (22 2) , 昼夜明暗节律 12 h:12 h, 基础体温 (37. 5 1. 0) , 单笼饲养, 自由进食水。实验所用 试剂均用无热源生理盐水稀释。 实验前对大鼠进行测温服习 7 d。测量体温时 将温度探头插入大鼠直肠 6 cm 处, 待数值稳定后读 数, 以给药前 1 h 测得的 3 次直肠温的平均
6、值为大 鼠基础体温。实验过程中记录大鼠体温 (0 1 h 内 每隔 15 min, 1 2 h 内每隔 30 min, 2 8 h 内每隔 60 min 测量 1 次) 。实验结束后检查插管位置, 舍 掉位置不正确的数据。 热应激处理: 将大鼠麻醉后置入42 人工气候 室中, 使其直肠温达42, 15 min。为了观察热应激 后下丘脑组织 HSP70 表达水平的变化, 分别于热应 激处理后 0、 4、 8、 12、 16 h 取材测定, 测定方法见后; 另外, 在热应激前 10 min 先将大鼠腹腔注射 HSP70 合成抑制剂放线菌酮 4 (Cycloheximide, CHX, 美国 Sig
7、ma 公司产品) , 再在 HSP70 表达高峰时测定 HSP70, 确认 CHX 对 HSP70 合成的抑制作用。 实验分组: 将 24 只大鼠随机分成 4 组, 每组 6 只。Control 组: POA 注射 1l 生理盐水; TNF- 组: POA 注射 TNF- 20 mgL -1 (北京宝赛公司产品) ; HS + TNF- 组: 热应激后 12 h POA 注射 TNF- 20 mgL -1; CHX + HS + TNF- 组: 热应激前 10 min 2. 5 mgkg -1剂量腹腔注射 CHX, 其余处置同 HS + TNF- 组。连续观察 8 h。 1. 2 下丘脑视前区
8、 (POA) 核团插管 用盐酸氯胺 酮 (上海第一生化药液公司产品) 和盐酸甲苯噻嗪 (美国 FAH 公司产品) 联合腹腔麻醉, 参照大鼠脑 图谱 (A Stereotaxic Atlas of the Rat Brain) , 用立体定 位仪向一侧 POA 区 (A: 7. 8 mm; R: 1 mm; V:- 1 mm) 插入一规格为 23 号的不锈钢管, 并留置与之相 匹配的针芯, 用牙科水泥固定。术后大鼠单笼饲养, 常规喂养 1 wk 后进行实验。 1. 3 下丘脑中 cAMP 含量的测定 在 TNF- 引起 4501中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bu
9、lletin 2005 Sep; 21 (9) : 1054 7 的发热高峰时将大鼠颈椎脱臼处死后, 快速取脑组 织于液氮中20 min, 之后 -70深冻冰箱保存待测。 取下丘脑组织 50 mg, 加 2 ml 冰醋酸, 进行匀浆, 3000 rmin -1离心 15 min, 取上清, 在 60 水浴中 用氮气将上清吹干, 之后按照 cAMP 放免检测试剂 盒 (上海中医药大学同位素室提供) 说明书进行测 定。 1. 4 采用 Western blotting 方法检测大鼠下丘脑 组织 HSP70 表达 取大鼠下丘脑组织, 冰浴匀浆, 4 离心12 000 rmin -1, 15 min,
10、 取上清, 再进行蛋 白定量之后, 进行电泳, 转膜, 封闭, 加抗 HSP70 抗 体 (武汉博士德生物有限公司产品) , 稀释倍数 1: 500, 二抗为羊抗兔 IgG (武汉博士德生物有限公司 产品) , DAB 显色。 1. 5 统计学处理 数据用*x s 表示; 体温变化情 况采用 T () 和体温反应指数 (Thermal response index, TRI) 分析。T 为即时体温与基础体温之差, TRI 为体温曲线与时间轴的面积积分。下丘脑组织 中 cAMP 含量用 pMmg -1湿重表示; 各组均数间比 较用 t 检验法检验。 2 结果 2. 1 热应激处理后 HSP70
11、表达水平以及放线菌酮 对 HSP70 表达的影响 从 Fig 1 可以看出热应激处 理后大鼠下丘脑组织 HSP70 表达水平逐渐增多, 在 12 h 时达高峰。而给予放线菌酮后可以明显抑制 HSP70 的表达, 各时间点 HSP70 表达均明显低于热 应激组。 Fig 1 The expression of HSP70 at 0, 4, 8, 12 and 16 h after heat treatment in HS and CHX + HS groups HS represents heat stress without CHX treatment; CHX + HS repre- sen
12、ts heat stress after CHX treatment. 0, 4, 8, 12 and 16 represent hours after heat stress. 10 g total protein was loaded in each lane. The experi- ment was repeated three times with slmilar results. 2. 2 TNF- 性发热过程的体温变化 将各实验组 的各时间点的体温值与基础体温的差值 T 求出, 绘制曲线为 Fig 2。结果可见: 向大鼠 POA 区注入 TNF- 后 (TNF- 组) , 在 1
13、5 min 内大鼠体温迅速升 高, 180 min 时达发热高峰 (T: 1. 85 0. 46) ; Control 组在观察期间未见体温明显变化; HS + TNF- 组体温略有升高, 但各时间点体温变化明显低于 TNF- 组, 两者之间差异有显著性; CHX + HS + TNF- 组则未见明显影响 TNF- 性发热的幅度。 同样体温反应指数的变化趋势与 T 相似。各组体 温变化最大值 Tmax及体温反应指数 TRI3、 TRI6(分 别为 3、 6 h 的体温反应指数) 见 Tab 1。 Fig 2 The body temperature change with time in di
14、fferent groups * x s, *P 0. 05) ; 但在热应激之前给予 Tab 2 Content of cAMP in hypothalamus among different experimental groups (*x s, n =6) GroupContent of cAMP/ pMmg-1 Control0. 66 0. 22 TNF- 1. 07 0. 33* HS + TNF-0. 67 0. 26+ CHX + HS + TNF-1. 10 0. 27* HS0. 65 0. 24+ *P 0. 05) 。 3 讨论 本实验采用 TNF- 制作了大鼠发热模型,
15、 给药 后 15 min 内大鼠体温即有升高, 经 3 h 达发热高峰 (T: 1. 85 0. 46) , 发热持续 8 h 以上。大量 文献证实 cAMP 是内生致热源 (Endogenous pyrogen, EP) 性发热的中枢介质之一, TNF- 作为一种内生 致热源很可能是通过升高下丘脑中的 cAMP 含量致 体温升高 5。本实验结果显示 TNF- 组发热高峰 时下丘脑内 cAMP 含量的升高与对照组相比差异有 显著性 (P 0. 05) 。以上 结果提示热应激后 TNF- 性发热效应减弱, 且很可 能通过高表达的 HSP70 来抑制下丘脑内的 cAMP 含量而实现的。 关于热应激
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