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1、东JS o 南u t h 大e a s 学tU n 学i v 报( M e d 医S c 学iE 版d i 2 0 0 8 , N o v ;2 7 ( 6 ) :3 9 7 4 0 3 、 。7 。 3 9 7 M u c o s a li m m u n i z a t i o nw i t hc o n s e r v a t i v eBc e l le p i t o p e s o fh e a ts h o c kp r o t e i ns t r e n g t h e n si m m u n er e s p o n s e J I AS h a o 。h u i ,D
2、E N GS h u a n g l i n g ,X I O N GQ i 。y a n ,Z H A N GY u ,L I OJ i n g - j i n g ,C A OR o n g y u e ( L a b o r a t o r yo f M i n i g e n eP h a r m a c y ,C h i n aP h a r m a c e u t i c a lU n i v e r s i t y ,N a 彬n g2 1 0 0 0 9 ,C h i n a ) A b s t r a c t :O b j e c t i v e T oi n v e s t
3、 i g a t es t r e n g t h e n i n ge f f e c to fM y c o b a c t e r i u mT u b e r c u l o s i s c o n s e r v a t i v eBc e l le p i t o p e s a n ds t u d yt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nh e a ts h o c kp r o t e i n6 5 ( H S P 6 5 ) a n da t h e m s c l e r o s i s M e t h o d sS i xBc
4、 e l l e p i t o p e sc l o s e l yc o r r e l a t e dw i t ha t h e r o s c l e r o s i sw e r ec l o n e da n dd i v i d e di n t o2g r o u p s ,f o l l o w e db yi n f u s i o ni n t o c h o l e r at o x i nBs u b u n i t ( C T B ) g e n ea n de x p r e s s i o ni nE s c h e r i c h i ac o l ir e
5、 s p e c t i v e l y T w oe x p r e s s i n gp r o d u c t sw e r e p u r i f i e d ,t h e nm i x e da n dr e n a t u r a t e d G M l E L I S Am a n i f e s t e dt h a tt h er e n a t u r a t e dp r o t e i nc o u l db ea s s e m b l e di n t o p e n t a m e r si nv i t r o I C Rm i c ew e r ep r e
6、i m m u n e dw i t ht h er e n a t u r a t e dp r o t e i nv am e m b r a n am u c o s an a s i ,t h e n s u b c u t a n e o u s l yi n j e c t e dh i s h d o s eo fH S P 6 5 R e s u l t s P h a r m a c o d y n a m i c se x p e r i m e n ti n d i c a t e dt h a tI C Rm i c e p r e i m m u n e dw i t
7、 ht h er e n a t u r a t e dp r o t e i ni n d u c e dm o r es t r o n gr e s p o n s ea g a i n s tH S P 6 5t h a nt h ec o n t r o lg r o u p C o n c l u s i o nM u c o s a li m m u n i z a t i o nw i t h h e a ts h o c kp r o t e i n c o n s e r v a t i v eBc e l le p i t o p e so fm y c o b a c
8、t e r i u m t u b e r c u l o s i ss t r e n g t h e n st h es u b s e q u e n ti m m u n er o s p o n s e s K e yw o r d s :a g g r e s s i v ei m m u n i z a t i o n ;a t h e r o s c l e r o s i s ;h e a ts h o c kp r o t e i n6 5 ;Bc e l le p i t o p e s ;m i c e C L Cn u m b e r Q 7 8 6 ;R 5 4 3
9、 5 D o c u m e n tc o d e A A r t i c l eI D 1 6 7 1 6 2 6 4 ( 2 0 0 8 ) 0 6 。0 3 9 7 0 7 H e a ts h o c kp r o t e i n6 0 6 5 ( H S P 6 0 6 5 ) i sah i g h l y c o n s e r v e df a m i l i e so fp r o t e i n H u m a nH S P 6 0a n dp r o k a r y o t i cH S P 6 5h a v e 7 0 a m i n oa c i ds e q u e
10、 n c eh o m o l o g y , w h e r e a sp r o k a r y o t i cH S P 6 5h a v eh o m o l o g y 9 7 a tt h e i r p r o t e i nl e v e l s H S P 6 0 6 5i s a l s oa l li m p o r t a n ta t h e r o s c l e - r o s i s ( A S ) r e l a t e dp r o t e i n A n t i H S P 6 0a n t i b o d i e sw e r e a l t o f r
11、 e q u e n f l yd e t e c t e di na t h e r o s c l e r o s i sp a t i e n t s ,a n dt h e a n t i b o d i e sc a nr e a c tw i t hH S P 6 5o fm y c o b a c t e r i u mt u b e r c u - l o s i s A n t i b o d i e sf r o mh e a l t h yp e r s o n sa n da t h e r o s c l e r e s i s p a t i e n t s w e
12、 r es c a n e d r e s p e c t i v e l y w i t hH S P 6 0a n d H S P 6 5 m a n yo f t h e i re p i t o p e sw e r ef o u n dt ob eC r o S S e p i t o p e s S o m er e s e a r c h sh a v ep r o v e dH S P 6 0 6 5a sar i s k f a c t o ro fi n d u c i n ga t h e r o s c l e r o s i s 1 引I ti sr e p o r
13、t e dt h a t i n t r a m u s c u l a r l yi n j e c t e dr e c o m b i n a t e dH S P 6 5o fm y c o - b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i sp r o m o t e da t h e r o s c l e r o s i s 。引H i i g h 。 c h o l e s t e r o ld i e t e dN e wZ e a l a n dr a b b i t sw e r es u b c u t a n e o u s l yi
14、n j e c t e dw i t hH S P 6 5o fm y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s o b t m n e df r o mB a c i l l eC a l m e t t eG u e r i n ( B C G ) 。w h i c hr e m a r k a b l yp r o m o t e da t h e r o s c l e r o s i s 4 剖A n t i H S P 6 5a n t i b o d i e sc o l l e c t e df r o ma t h e r o
15、s c l e r o s i sp a t i e n t sr e c o g n i z e d H S P 6 5e x p r e s s e db yas e r i e so fm i c r o b e T h e r ea r es i x c r o s se p i t o p e sb e t w e e nH S P 6 0a n dH S P 6 5 ,t h ec r o s s e p i t o p e sw e r el t h ,2 t h ,4 t h ,5 t h ,7 t ha n d8 t he p i t o p e s h o w ni nF
16、i g1 ,a n t i b o d i e si n d u c e db yt h e s ee p i t o p e sf r e q u e n t l ys e e ni nv i v oo fa t h e r o s c l e r o s i sp a t i e n t s 【6 引,i n d i c a - t i n gt h a tt h es i xe p i t o p e sa r ea t h e r o s e l e r o s i sa s s o c i a t e d p r o t e i n P e o p l e sa r ei n e v
17、 i t a b l yi n f e c t e db ym a n yp a t h o g e n - i cm i c r o o r g a n i s m ss u c ha sM y c o b a c t e r i u ms p ,C h l a m y d i a t r a c h o m a t i s ,P o r p h y r o m o n a sg i n g i v a l i sa n ds oo n W h e n m i c r o b e sp r o v o c a t e ds o m eb o d y 。c o r r e l a t e dd
18、 i s e a s e sv a m u c o s a ,a n dt h et h a l l u sr e p e a t e d l yi n f e c t e da n dd i e d ,d u r - i n gt h i sp r o c e d u r e ,b o d yr e l e a s e ds o m ed o m i n a n ta n t i g e n s t oi n d u c er e p e a t e dm u c o s ai m m u n o s t i m u l a t i o na n dg e n e r - a t ec o
19、r r e s p o n d i n gi m m u n er e s p o n s e s I tw a sr e p o r t e dt h a t m u c o s a li m m u n i z a t i o ni n d u c e di m m u n et o l e r a n c e ,h o w e v e r o u rs t u d ys h o w e dt h a ti m m u n i z e dI C Rm i c ew i t ho u rp r o - t e i nv i am u c o s ad i dn o ti n d u c ei
20、 m m u n et o l e r a n c e ,o nt h e c o n t r a r y ,i ts t r e n g t h e n e ds u b s e q u e n ti m m u n er e s p o n s e ,w e F o u n d a t i o ni t e m T h i sw o r kw 8 8s u p p o r t e db yt h eN a t i o n a lN a t u r a lS c i e n c eF u n dC o m m i t t e e ( 3 0 6 7 2 4 6 4 ,3 0 5 0 0 4
21、5 8 ) B i o g r a p h i e s J I AS h a o 。h u i ( 1 9 7 7 一) ,m a l e ,b o r ni nW u h a no fH u b e ip r o v i n c e ,e n r o l l e dp 0 咆瞰l 埘t e s ,m i c r o b ea n db i o c h e m i s t r yp h a r m a c y E m a i l : 2 0 9 5 8 4 3 4 s i n a c o r n C o r r e s p o n d i n ga u t h o r C A OR o n g
22、 - y u eT e l :8 6 “ 2 5 - 8 3 2 7 1 3 6 9 ;E m a i l :c a o r o n g y u e n a n j i n g y a h o o 1 c n 万方数据 3 9 8 东南大学学报( 医学版)2 0 0 8 年1 1 月,2 7 ( 6 ) c o n c l u d e dt h a tt h eh e a ts h o c kp r o t e i nr e l e a s e db yr e p e a t - e dm u c o s a li n f e c t i o na g g r a v a t e da t h
23、 e r o s c l e r o s i s T h es i x e p i t o p e sw e r ec o n j u n c t e d w i t hc h o l e r at o x i nBs u b u n i t ( C T B ) a n dr e p e a t e d l yi m m u n i z e dI C Rm i c ew i t hl o w d o s eo fp r o t e i nt oi n v e s t i g a t et h es t r e n g t h e n i n ge f f e c to n Q U E R Y
24、Q U E R Y Q U E R Y Q U E R Y s u b s e q u e n ta g g r e s s i v ei m m u n i z a t i o n O u re x p e r i m e n t i s a i m i n ga ts t u d y i n gt h ef u n c t i o no fm u c o s a li m m u n i z a t i o n M y c o b a c t e r i u mT u b e r c u l o s i s c o n s e r v a t i v e Bc e l le p i t o
25、 p e s t oa t h e r o s c l e r o s i s Y A K D V K F G A D A R A L M L Q G V D L L A D A v A v T M G P K G R T V I I E Q S W G S P K v T K D G V T V A K S I D - - M A K T I A Y D E E A R R G L E R G L N A L A D A V K V T L G P K G R N V V L E K K W G A P T I T N D G V S I A K E I E 1 02 03 04 05 06
26、 0 9 01 0 01 1 01 2 01 3 01 4 0 L K D K Y K N I G A K L V Q D V A N N T N E E A G D G T T T A T V L A R S I A K E G F E K I S K G A N P V E I R R G V M 1 励P 艇研6 皿E V A K K T D D V A G D G T T T 2 A T 形纠硎腕占磁R N V 从G A X I I ,( 、? ( ; 。而一 8 0 9 0 丽矿一 11 01 2 0 1 5 01 6 01 7 0 1 8 01 9 02 0 0 Q U E R Y
27、L A V D A V I A E L K K Q S K P V T T P E E I A Q V A T I S A N G D K E I G N II S D A M K K V G R K G V I T V K D G K - Q U E R YK A k h V T E T L L K S A K E V E T K D Q I A A T A A I S A G D Q S I G D L 4 型旦幽堕坦丝鲤笙幽N 1 3 01 4 01 5 01 6 01 7 0 2 1 02 2 02 3 02 4 02 5 02 6 0 Q U E R YT L N D E L E I
28、I E G M K F D R G Y I S P Y F I N T S K G Q K C E F Q D A Y V L L S E K K I S S I Q S I V P A L E I A N Q U E R Y T F G L Q L E L T E G M R F D K G Y I S G Y F V T D A E R Q E A V L E 5 旦2 盥互匕呈堑匕! ! 堑璺L P L f L E K V I 1 8 01 9 02 0 02 1 02 2 02 3 0 2 7 02 8 02 9 03 0 03 1 03 2 0 Q U E R YA H R K P
29、L V II A E D V D G E A L S T L V L N R L K V G L Q V V A V K A P G F G D N R K N Q L K D M A I A T G G A V F - Q U E R YQ A G K ,t 。L I I A E D V E G E A L S T L V V N K I R G T F K S V A V K A P G F G D R R K A M L Q D M A I L T G G Q V I 2 4 02 5 02 6 02 7 02 8 02 9 0 3 3 0 3 4 03 5 03 6 03 7 03 8
30、 0 Q U E R YG E E G L T L N L E D V Q P H D L G K V G E V I V T K D D A M L L K G K G D K A Q I E K R I Q E II E Q L D V T T S E Y - Q U E R YS E E V G L S L E S A D S i i ( j Kj f 讣: K I ) E T T I V E G A G D S D A I A G R V A Q I R T E I E N S D S D Y 3 0 03 1 0 3 2 0 3 3 0 3 4 03 5 0 3 9 04 0 04
31、1 04 2 04 3 04 4 0 Q U E R YE K E K L N E R L A K L S D G V A V L K V G G T S D V E V N E K K D R V T D A L N A T R 从V E E G I V L G G G C A L L - Q U E R YD R E K L Q E R L A K L A G G V A V I K A G A A T E V E L K E R K H R I E D A V R N A K A A V E E G I V A G G G V A L L 3 6 03 7 03 8 03 9 04 0
32、04 1 0 4 5 04 6 0 4 7 04 8 04 9 05 0 0 Q U E R YR C I P A L D S L T P A N E D Q K I G I E II K R T L K I P A M T I A K N A G V E G S L I V E K I M Q S S S E V G Y D A : Q U E R YH A I P A L D E L K P E G E 7 f 纠T G A N I V K V A L E A P L K O I A F N G G L E P G V V A E K V R N S P A G T G L N A 4 2
33、 04 3 0 4 4 04 5 04 6 04 7 0 5 1 05 2 05 3 0 5 4 05 5 05 6 0 Q U E R YM A G D F V N M V E K G II D P T K V V R T A L L D A A G V A S L L T T A E V V V T E I P K E E K D P G M G A b l G G M G : Q U E R YA T G E Y E D L L K 8 4 丝筮丛幽,Q N A A S I A G L F L T T E A V V A D K P E K A A A P A G D P T G G M
34、 G 4 8 04 9 05 0 05 1 0 5 2 0 5 3 0 Q U E R YG Q U E R YG F i g1 T h ec r o s se p i t o p e so i lH S P 6 5b e t w e e nH S P 6 5a n dH S P 6 0 万方数据 贾绍辉,等热休克蛋白保守性B 细胞表位黏膜免疫可增强免疫应答 3 9 9 C T Bi sap e n t a m e r i cn o n 。t o x i np o r t i o n ,r e s p o n s i b l ef o r t h eh o l o t o x i nr e c
35、 o g n i z i n gt h eG M lg a n g l i o s i d er e c e p t o r s ,a g l y c o l i p i dt h a ti sc o n s t i t u t i v e l ye x p r e s s e do nt h es u r f a c eo f t h et a r g e te p i t h e l i a lc e l l s C T Bh a sb e e nd e s c r i b e d 鹊a p o t e n ti m m u n o g e ni nt h ei n t e s t i n
36、 a la n dn a s a lm u c o s a l s i t e s 1 l 。am u c o s a la d j u v a n tf o rn a s a lv a c c i n e s 1 2 - 1 3 1M a t e r i a l sa n dM e t h o d s 1 1M a t e r i a l s n l ev e c t o r so fp E T 2 8 a 。C T B _ P 2 7 7a n d p E T - 2 8 a H s p 6 5w e r ep r o v i d e db yo u rl a b o r a t o r
37、y A l lr e s t r i c t e d e n d o n u e l e a s e sa n dT 4l i g a s ew e r ep u r c h a s e df r o mF e r - m e n t a 8 U S A D E A E 5 2 。c e l l u l o s ew 鼬o b t a i n e df r o m W h a t m a n ,U S A G o a ta n t i 。m o u s eI S Gh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( H R P ) 。c o n j u g a
38、 t e da n t i b o d yw a sp u r c h a s e d f r o m B o s t e rB i o 。T e c h n o l o g yC o L t d I C Rm i c eo f d e p u r a t o r y h i e r a r c h yw i t hb o d yw e i g h to fl8 2 0gw e r ep u r c h a s e d f r o mC o m p a r a t i v eM e d i c i n eC e n t e ro fY a n g z h o uU n i v e r s i
39、t y ,t h eP e r m i tL i c e n c eo fA n i m a lw a sS C X R ( S u ) 2 0 0 7 - 0 0 0 1 1 2V e c t o r sc o n s t r u c t i o n I nt h e s es i xe p i t o p e s ,t h r e eo ft h e m ( 1 ,2a n d8 ) w e l l e a s s o c i a t e dw i t hi n i t i a la t h e r o s c l e r o s i s ,a n do t h e r s ( 4 ,5a
40、 n d 7 ) w e r er e l a t e dt oa d v a n c e da t h e r o s c l e r o s i s T w ov e c t o r s w e r ec o n s t r u c t e dr e s p e c t i v e l yc o n t a i n i n gt h r e ee p i t o p e s 1 2 1C o n s t r u c t i o no fp E T 2 8 a 。C T B 。8 一l - 2 U s i n gP E T 2 8 a H S P 6 5 鹊t e m p l a t e t
41、 h eo l i g o n u c l e o t i d ew h i c hw a sv a r i o u sp r i m e r ,s h o w ni nT a b1 8 u pa st h e f o r w a r dp r i m e ra n d8 l o wa st h er e v e r s ep r i m e r ,w es y n t h e s i z e dt h eg e n eo ft h e8 t he p i t o p eb yP C R ,P C Rw e n t t h r o u g h3 0c y c l e so fd e n a t
42、 u r i n ga t9 4o C f o r5 0s ,a n n e a l i n ga t6 5 f o r4 5s a n de x t e n s i o na t7 2 f o r2 0s T h ep r o d u c to fP C Rw a sp u r i f i e da n du s e da st h en e x t t e m p l a t e ,t h eo l i g o n u c l eo f8 u pw a st h ef o r w a r dp r i m e r a n d1l o w lw a st h er e v e r s ep
43、r i m e r ,P C Rw e n tt h es a m e s t e p s ,a n dt h ep r o d u c tw a sp u r i f i e dt os e r v ea s an e wt e r n p l a t e ,t h eo l i g o n u c l e o t i d e so f8 u pa n d1l o w 2w e r et h ef o r - w a r da n dr e v e r s ep r i m e r ,t h u sw es y n t h e s i z e dg e n e so ft h e 8 t h
44、e p i t o p ec o n n e c t e dw i t ht h ef i r s te p i t o p e A c c o r d i n g l y , u s i n gt h e8 u pa n d2 1 0 w la sonep a i rp r i m e r s ,t h e8 u pa n d 2 1 0 w 2a sa n o t h e rp a i rp r i m e r s ,w es y n t h e s i z e dt h eg e n e w i t hi t s8 t he p i t o p ec o n n e c t e dw i
45、 t hi t sf i r s ta n ds e c o n d e p i t o p e s A f t e rb e i n gp u r i f i e d ,t h ea m p l i f i e df r a g m e n t s w e r ed i g e s t e dw i t he n d o n u c l e a s eN h eIa n dH n dI na n d i n s e r t e di n t ot h ep E T 2 8 a C T Bp r e v i o u s l y d i g e s t e dw i t h N h eIa n
46、dH i n dmt of o r man e we x p r e s s i n gv e c t o r ,w h i c h w a sn a m e dP E T2 8 一C T B - 8 一l - 2 T h ec o n s t r u c t e dv e c t o r s w e r et r a n s f o r m e di n t oE c o l iB L 21 ( D E 3 ) T h er e s u l t a n t c o l o n i e sw e r es c r e e n e da c c o r d i n gt oi t sk a n
47、a m y c i nr e s i s t - a l i c e ,a n dt h e nu n d e r w e n tP C Ra n ds e q u e n c i n gt oc o n f i r m c o r r e c ti n s e r t i o n T a b1P r i m e ro fp E T 2 8 a C T B 。8 。1 2 1 2 2 C o n s t r u c t i o no fp E I 2 8 a C T B - 4 - 7 - 5 U s i n gp E T 2 8 a H s p 6 5a st h et e m p l a t e ,v a r i o u sp r i m e r w a ss h o w ni nT a b2 4 u pa st h ef o r w a r dp r i m e r 。4 l o wa s t h er e v e I f ep r i m e r t h e4 t he p i t o p ew a ss y n t h e s i z e db y P C R3 0c y c l e so fd e n a t u r i
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