牛眼虹膜色素上皮细胞的甘露糖受体表达.pdf
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1、!实验研究! 牛眼虹膜色素上皮细胞的甘露糖受体表达 李毅斌孙葆忱 “摘要# 目的观察体外培养的牛眼虹膜色素上皮$ % 方法采用 抗体为一抗1采用免疫组织化学染色对培养的2 3 4细胞进行鉴定;? 根据D + , E 6 , F中牛巨噬细胞甘露糖受体的相关系基因列设计特异引物1 对其*7 BC的表达进行逆转录聚合酶链反应$ 结果培养获得的2 3 4细胞无其它细胞污染1提取的2 3 4细胞总7 BC完整1无降解; 7 ?J 3 K 7检 测结果显示1体外培养牛眼2 3 4细胞可表达甘露糖受体的*7 BC;结论体外培养的2 3 4细胞可表达甘 露糖受体的*7 BC1有可能具有与7 3 4细胞相似的特
2、异性7 9:吞噬功能; “关键词# 色素上皮1眼L虹膜L甘露糖受体L逆转录聚合酶链反应L细胞培养 中图分类号M 7 J N N A 7 N N O P = Q = R S T U V W W X Y ZY Z Z Y W V U V _ V T Y UX Z_ a b a U V cd Y e X Z VX U X WT X f V Z V T X g V b X b_ V b b WX Ze X U Yh ij k l k m 1n op q r s t u v m Pq v k w k m xi m y z k z z vs | u z u r ! “s ! s x # 1$ | | !
3、k r z v % = J N ?;故甘露糖受体的 表达情况可反映 7 3 4细胞对7 9:的特异性吞噬功 能;为此1我们采用逆转录聚合酶链反应$ 7 ?J 3 K 7 5对 体外培养牛眼2 3 4细胞中甘露糖受体的*7 BC表达 进行了检测1以了解2 3 4细胞是否具有与7 3 4细胞相 似的特异性7 9:吞噬功能; 材料和方法 P 主要试剂和材料 作者单位M = ,北京1首都医科大学附属同仁医院1北京市眼科研究所 新生牛眼由北京市南郊牛奶公司红星生化厂提 供;胎牛血清$杭州三利生物制品公司提供5 1 抗体B即用型免疫组织化学超 敏 链霉菌抗生物素蛋白J过氧化酶法$ - 3 K 7引物以克隆
4、自牛眼7 3 4细胞的相关基因序 列为对象进行引物设计1并由上海生工生物技术公司 负责设计合成;看家基因选用6 J 6 H - % , 1相关引物也由 上海生工生物技术公司负责设计合成;3 K 7引物序列 H, 中华眼底病杂志A A年N月第= H卷第=期 K . % ,I9H 0 / A 0 , 3 0 G % 1 =6 (的9 ?生理盐水2 A后将眼球取出“再 次无菌生理盐水淋洗后进行6 7 8细胞分离和培养2采 用BC D 9 E酶辅助的显微分离法进行 6 7 8细胞分离2每 F个眼球的6 7 8细胞接种一个培养瓶# $) : ( “ 加$:含 = G胎牛血清的 H - 2接 种 6 7
5、8细 胞 于 铺 有 :W :盖玻片的U孔板中“ 每孔接种$ = =X 细 胞悬液2静置9 =:0 1 “待细胞开始贴壁后每孔加入含 = G胎牛血清的H - 2于I J孵箱“ $ G I JK L $ GJK M ?下培养 F9天“ 终止培养进行 免 疫组织化学染色2分别以鼠抗 细 胞 角 蛋 白 抗 体 # Y8 , O 0 N “吸管反复吹打使瓶壁上的6 7 8细 胞完全游离并与, O 0 N 充分作用2将, O 0 N 移入一: 离心管“室温静置$:0 1 2加 = =X 氯仿“剧烈振摇 离心管“加等量异丙 醇“ c = ?沉降A 29 ?离心“ “ 9 ?离心“ 8 7 I水溶 解a
6、PY2取X 溶液“进行= 4 VG琼脂糖电泳2 3 4 d a e- 7 I a 3 4 d 4 3 逆转录取X a PY溶液“采用随机引物法 进行逆转录2逆转录体系如下! a PY X “ f- fg h # = =i; X ( “ a 1 * b 0 1= 4 $X “随机引物 “ T Pe 7 X “ $ W_ C j j O9X “ 8 7 I水L 4 $X 2逆转录条件为! M ?“ “引物 ; X ( “引 物#甘 露 糖 受 体“ ; X ( X # $k :N ( “ T Pe 7X “ e * l酶= 4 9X # i( “ f+ I # ; g ( “ 纯水 2反应 条件为
7、!预变性“ L 9 ?“ 一 步 法 提 取6 7 8细 胞 总a PY“经 = R V G琼脂糖凝胶电泳“可见清晰的 VZ亚基和 H C 1 T C b 0 b “ f* O = = “ hN )之比+ 2 ?= 2 + ?=图A : 4 B # C :结果D E F G+ H # C :IE 5 J G 5 ( + , ,K L ) M D E F G= H N B E O P 6 F ( = Q K L ) M D E F GQ H甘露糖受体( % R S K L ) TN B E O P 6 F ( = Q K L ) U V W X! “ # $ C Y8 Z L 5 6 IE 5
8、O 9 P 5 G 6 F E %E Z P G 5 L 9 E P 6 F X4 _ G O 9 P 5 G “ # $ C Y E 5 G L 8 9 8 F E 9 E F _ E G F IG 5 8 Y IG 9 E F 8 Y 8 IG Y E P _ G 5 6 F E 5 8 F P _ GF O 9 G 6 ( a_ 6 P GE 5 5 8 a) “ F G 5 P G L _ E Y G B O 8 F P 5 E Y P I6 O 5 8 Y O 8 L Ga6 P _ 5 G G FZ 6 9 P G 5 *+ , , U V W X- “ II F 8 _ 6 Y
9、P 8 O _ G I6 O E 9 Y P E 6 F 6 F 8 Z O P 8 J G 5 E P 6 F 6 FO 9 P 5 G “ # $ C Y X; IG 5 8 Y K 5 8 aFO P 8 J G 5 E P 6 F 5 E F 9 G Y Y P E 6 F G ( K 9 E O JE 5 5 8 a) O E FK G Y G G F6 FP _ G L 9 E Y IE8 Z P _ G O G 9 9 Y . /0 *+ , , U V W X 1 “ II F 8 _ 6 Y P 8 O _ G I6 O E 9 Y P E 6 F 6 F 8 Z 2 + ,
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