托吡酯对大鼠脑缺血再灌注后氨基酸释放的影响.pdf
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1、主垦塞旦塑丝壅疸盘查! 塑! 生! 旦箜! ! 鲞筮! 塑曼! ! ! ! 塑! ! ! 呈! ! 垡旦! ! ! ! ! ! ! ! 盟! ! ! 竺! ! 望! ! ! ! 塑丛! ! :! ! ! ! :! ! ! :! ! 塑! :! 。1 1 托吡酯对大鼠脑缺血再灌注后氨基酸释放的影响 卢艳秋D 娄季宇2 郑州大学第二附属医院1 ) 重症监护病房2 ) 神经内科郑州4 5 0 0 1 4 【摘要】 目的研究鼠脑缺血再灌注损伤后脑组织兴奋性氨基酸( E A A ) 的变化及托吡酯的影响。探讨托吡酯的神经保 护作用机制。方法用线栓法制备S D 大鼠大脑中动脉阻塞再灌注( M C A O
2、) 模型,托吡酯1 0 0 m g k g 灌胃。1 次d ,通过免疫 组化染色变化观察不同组N M D A R l 及G A B A 染色变化。结果单纯缺血再灌注组与假手术组相比大鼠脑缺血侧脑组织 G A B A a 明显降低,托吡酯治疗组较单纯缺血组G A B A a 增高。托吡酯预防组G A B A a 含量较单纯缺血再灌注组明显增高。单 纯缺血组与假手术组相比大鼠脑缺血侧脑组织N M D A R l 明显降低,托吡酯治疗组较单纯缺血组N M D A R I 受体量降低,托 毗酯预防组N M D A R l 受体量与单纯缺血再灌注组相比明显降低。结论 托毗酯保护大鼠脑缺血的重要机制之一可
3、能是通 过抑制兴奋性氨基酸释放,提高抑制性氨基酸释放及改变其受体表达实现的。 【关键词】局灶性脑缺血;托吡酯;N M D A R l ;G A B A 【中图分类号】R 一3 3 2【文献标识码】A【文章编号】 1 6 7 3 5 1 1 0 ( 2 0 0 9 ) 0 6 0 0 1 1 - 0 3 E f f e c t so ft o p i r a m a t eo nt h er e l e a s eo fe x c i t a t o r ya m i n oa c i d sa f t e rc e r e b r a li s c h e m i aa n dr e p e
4、r f u s i o ni nr a t s L uY a n q i u ,L o uJ i y u T h eS e c o n dA f f i l i a t e dH o s p i t a lo fZ h e n g z h o uU n i v e r s i t y ,Z h e n g z h o u4 5 0 0 1 4 ,C h i n a A b s t r a c t 0 b j e c t i v eT os t u d yt h ee f f e c to ft o p i r a m a t eo nE A Ai nb r a i nc o n s t i t
5、 u t i o na f t e rc e r e b r a li s c h e m i ar e p e r f u s i o n i n j u r y ,a n dt Oe x p l o r et h en e u r o p r o t e c t i v em e c h a n i s m so ft o p i r a m a t e M e t h o d sAm o d e lo ff o c a li s c h e m i cr e p e d u s i o ni nS Dr a t s w a si n d u c e db yi n t r a t u m
6、 i n a lm i d d l ec e r e b r a la r t e r yo c c l u s i o n ( M C A 0 ) w i t han y l o nm o n o f i l a m e n ts u t u r e T o p i r a m a t e ( 10 0 r a g k g ) o r a l l ye v e r y d a y ,i m m u n o h i s t o c h e m i c a lt e c h n i q u ew a su s e dt oo b s e r v et h ee x p r e s s i o n
7、o fN M D A R la n dG A B A R e s u l t s G A B A ar e c e p t o r - p o s i t i v ec e l l si ni s c h e m i a - r e p e H u s i o ng r o u pd e s c e n d e dc l e a r l yt h a nt h a ti ns h a m - o p e r a t e dg r o u p G A B A ar e c e p t o r - p o s i t i v ec e l l si nT P Mt r e a t e dg r o
8、 u pi n c r e a s e dt h a nt h a ti ni s c h e m i a r e p e r f u s i o ng r o u p T h e nt h en u m b e r si nT P Mp r e v e n t e dg r o u pi n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yt h a nt h a ti ni s c h e m i a r e p e r f u s i o ng r o u p N M D A R lr e c e p t o r - p o s i t i v ec e l
9、l si ni s e h e m i a r e p e r f u s i o ng r o u pd e s c e n d e dc l e a r l yt h a nt h a ti ns h a m o p e r a t e dg r o u p N M D A R lr e c e p t o r - p o s i t i v ec e l l si nT P Mt r e a t e dg r o u p i n c r e a s e dt h a nt h a ti ni s e h e m i a r e p e r f u s i o ng r o u p 。T
10、h e ot h en u m b e r si nT P Mp r e v e n t e dg r o u pi n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yt h a nt h a t i ni s c h e m i a - r e p e r f u s i o ng r o u p C o n c l u s i o nO n eo ft h ei m p o r t a n tm e c h a n i s m so ft o p i r a m a t ef o ri s c h e m i ai nt h er a t si sb yt h
11、 e w a y o fi n h i b i t i n ge x c i t o t o x i c i t ya m i n oa c i dr e l e a s e ,e n h a n c i n gi n h i b i t o r ya m i n oa c i dr e l e a s ea n dc h a n g i n gi t sr e c e p t o re x p r e s s i o n K e yw o r d s l F o c a lc e r e b r a li s c h e m i a ;T o p i r a m a t e ;N M D A
12、 R l ;G A B A 目前关于缺血性脑血管病的常规治疗中( 如脑 保护治疗) 也有间接的兴奋性氨基酸抑制作用,但直 接针对脑缺血中兴奋性氨基酸毒性作用治疗的药物 十分少见。托吡酯( t o p i r a m a t e ) 是一种治疗癫痢的 良好药物,其药理作用表明托吡酯能阻断兴奋性氨 基酸受体,增强7 一氨基丁酸( G A B A ) 介导的抑制性 作用,从而起到稳定细胞膜,抑制兴奋性氨基酸毒性 的作用。鉴于托吡酯对兴奋性氨基酸良好的抑制作 用,是否能将其应用到缺血性脑血管病的治疗中,以 减轻脑缺血时兴奋性氨基酸毒性损害? 本研究为应 用托吡酯治疗脑缺血提供理论依据。 1 材料与方法
13、 1 1 实验动物与分组采用健康雄性S D 大鼠8 6 只,体质量2 3 0 2 8 0 9 ,由郑州大学实验动物中心提 供。随机分为3 组:A 假手术组,B 缺血再灌注组, C 预防性托吡酯组。脑缺血再灌注术前3 d 开始给 药,1 0 0 m g k g 灌胃,q d ,末次给药3 0 m i n 后行脑缺 血再灌注手术。 1 2 局灶性脑缺血再灌注模型的制备大鼠1 0 水合氯醛腹腔注射麻醉( 3 5 0 m g k g ) ,模型制备按 K u g eY 等 1 报告的方法进行。缺血判定标准:缺 血动物左侧上、下肢体瘫痪,围绕左侧呈逆时针绕圈 ( 追尾现象) 。无上述症状及有痉挛和意识障
14、碍的大 鼠剔除。 1 3 标本采集和组织切片的制备各组大鼠在规 定时间点取材。大鼠在水合氯醛( 3 0 0m g k g ) 麻醉 下,经心脏灌注固定后开颅取脑,于前囟前2 m m 至 前囟后3 r a m 之间取脑,置入4 0 9 L 多聚甲醛( 含 0 2 9 LD E P C ) 后固定2 h ,蒸馏水浸泡4 h 。常规梯 度乙醇脱水,二甲苯透明,浸蜡,包埋。粘于多聚赖 氨酸处理后的玻片上,温室保存,用于N M D A 、G A B A 免疫组化染色。 1 4 N M D A 免疫组化检测 用兔抗N M D A 受体 万方数据 1 2 垦塞旦煎丝壅瘟盘查! ! ! ! 生! 旦整! !
15、鲞箜! 塑堡! i ! 塑! 业! ! 型! ! ! ! ! 竺生型丛! 竺! 塑望! ! ! ! 竺坚! ! :! ! ! ! :Y ! ! :! ! 塑! :! a 1 亚单位多克隆抗体( S a n t aC r u z 公司,1 :3 0 0 稀 释) ,对切片做S A B C 漂浮片方法染色标记。于4 0 0 倍物镜下分别计数大脑皮质5 个不同部位的阳性 细胞数,取平均数。 1 5 G A B A 免疫组化检测石蜡切片常规脱蜡至 水,用S A B C 法标记,所有I 抗、抗均购自北京中 山生物工程有限公司,检测程序按照试剂盒说明书 严格操作。观察海马C A l 区切片,每个切片取1
16、0 个视野阳性细胞平均数,以阳性神经元数高倍镜视 野表示。 1 6 统计学方法组内比较采用单因素方差分析, 组间比较采用t 检验。数据用均数标准差表示,P O 0 5 为差异有统计学意义。数据均应用S P S S 1 0 0 软件进行统计学处理。 2 结果 2 1 脑缺血再灌注后神经元细胞N M D A 的变化 假手术组大鼠N M D A 免疫阳性细胞表达主要在 神经元,N M D A 免疫组化染色阳性细胞胞浆、胞膜 染成棕黄色,大鼠大脑皮质阳性细胞表达单纯缺血 组为( 2 5 3 3 士2 2 5 ) ,与假手术组的( 3 5 5 0 _ - - 4 - 1 3 8 ) 相比,大鼠脑缺血侧大
17、脑皮质N M D A 阳性细胞数 明显降低( P 0 0 1 ) ,T P M 治疗组的( 1 0 6 7 土 1 0 3 ) 较单纯缺血组N M D A 免疫阳性细胞数降低 ( P 0 0 5 ) 。而T P M 预防组N M D A 免疫阳性细 胞数与单纯缺血组相比则明显降低( P 0 0 1 ) 。 2 2 脑缺血再灌注后神经细胞G A B A 的变化假 手术组大鼠免疫阳性细胞在大脑皮质和海马普遍存 在。免疫阳性神经元胞浆呈棕色。与假手术组的 ( 5 8 1 6 土1 7 2 ) 比较,单纯缺血组的( 1 9 6 7 士2 8 0 ) 、 T P M 治疗组的( 3 8 6 74 - _
18、 1 6 3 ) 及T P M 预防组的 ( 3 1 5 0 4 - 1 3 8 ) G A B A 免疫阳性神经元数量均明显 减少,其中T P M 治疗组较单纯缺血组G A B A 免疫 阳性细胞数升高( P 0 0 5 ) ,T P M 预防组G A B A 免疫阳性细胞数与单纯缺血组相比则明显升高( P 0 0 1 ) 。 3 讨论 脑缺血时,缺血神经元大量释放的E A A ,尤其 在G l u 神经元的损伤起关键作用。目前研究表明 E A A s 受体可分两大类,即N M D A 受体与非N M D A 受体。介导G A B A 中枢效应的受体至少有3 种 不同类型,即G A B A
19、a 、G A B A b 和G A B A c 受体,其 中以G A B A a 受体分布最广泛,并在缺血性脑损伤 的神经保护中占主导地位。研究显示 2 ,G A B A a 受体极易受到缺血状态的影响,缺血早期主要表现 为C A l 和C A 2 区锥体细胞和颗粒细胞上m R N A 表达降低。有研究L 3 3 证明,增强G A B A a 受体的活 性有助于神经元的存活和功能重建。另也有研究证 明 4 ,联合给予N M D A 受体阻断剂M K 一8 0 1 和 G A B A a 受体激动剂m u s c i m o l 可以阻断缺血对大 鼠大脑的损伤作用。G a l e f f i 等
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