抗菌肽FALL39及其突变肽对诱生型一氧化氮产生的影响.pdf
《抗菌肽FALL39及其突变肽对诱生型一氧化氮产生的影响.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《抗菌肽FALL39及其突变肽对诱生型一氧化氮产生的影响.pdf(4页珍藏版)》请在三一文库上搜索。
1、第2 8 卷第6 期 2 0 0 8 年1 2 月 国际病理科学与临床杂志 h t e m a t i o n a lJ o u m a l0 fP a l h o l o 科柚dC l i n i c a lM e d i c i n e V 0 1 2 8 n e c N o 6 2 0 0 8 论著 抗菌肽F A L L 一3 9 及其突变肽对诱生型一氧化氮产生的影响 郝杰杨云霞,王伯瑶 ( 四川大学华西基础医学与法医学院,成都6 1 0 0 4 4 ) 摘要目的:比较人抗茵肤F A L L - 3 9 及其突变肽对细菌脂多糖( 1 i p 叩0 l y s a c c h 鲥d e 8
2、 ,u ) s ) 介导的诱生型一 氧化氮( n i t r i co x i d e ,N O ) 产生的影响。方法:体外常规培养人单核吞噬细胞T H P 1 ,L P s 刺激细胞,分别用人抗茵 肽F A L L - 3 9 以及突变肽F A L L - 3 9 L y s 2 4 ,F A L L 3 9 一L y s 3 2 ,F A L L - 3 9 L y s 2 4 3 2 处理细胞。应用R T P C R 方法测定L P S 诱生型一氧化氮合酶( i n d u c e dn i t r i co x i d es y n t h a ,i N O S ) 以及F A L L
3、 - 3 9m R N A 的表达,用硝酸还原酶法测定细胞 培养上清液中N 0 的含量。小鼠腹腔注射更生霉素和L P s 建立内毒素血症模型,分别用抗茵肤处理动物,取血测定 血清中N 0 的含量。结果:U ) s 刺激F A L L 3 9m R N A 的表达增加;同时也诱导N 0m R N A 的表达以及细胞培养上清 液中N 0 含量的增加。人抗茵肤F A L L 3 9 及其突变肽F A L L 3 9 L y s 2 4 ,F A L L - 3 9 L y s 3 2 ,F A L L 3 9 L y s 2 4 3 2 可以抑制 u ) s 诱导的N O 的产生;其中F A L L
4、 - 3 9 - L y s 2 4 3 2 的抑制作用最为明显。结论:抗茵肽F A L L - 3 9 及其突变肤具有抗内 毒素作用,其机制与抑制吣诱导的N 0 产生有关。 关键词抗茵肤;F A u 广3 9 ;突变;一氧化氮 【中图分类号 R 3 6 4 5 文献标识码】A 文章编号】1 6 7 3 - 2 5 8 8 ( 2 0 0 8 ) 0 6 J D 4 6 l J D 4 E f f e c to fa n t i b a c t e r i a lp e p t i d eF A L L - 3 9a n di t sm u t a n tp e p t i d e so n
5、p r o d u c t i o no fI l i t r i cO x i d ei n d u c e db yl i p o p o l y s a c c h a r i d e s H A OJ i e ,Y A N GY u n - x i a ,W A N GB o - y a o ( 耽咖吼讯口S 矾D 甜矿Z i r 妇面d 肋黼如肘列如沁,l s 如 眦儿,访世r s 缸y ,c 明础6 1 0 0 4 l ,吼妇m ) A b s t r 躯t o b j 6 v e T os t u d yt l l ee 虢c to fa n t i b a c t 葫a lp
6、e p t i d eF A L L - 3 9 锄di tm u t a n t p e - t i d e so np r o d u c t i o no fn i t r i co x i d e ( N O ) i n d u c e db yl i p o p o l y s a c c h 撕d e s ( U ) s ) M e t h o d s7 I H P - 1 c e U sw e r et r e a t e dw i t IU 玛,F A L L - 3 9 肌di tr n u t a n tp e t i d e sF A L L - 3 9 L y s 2
7、4 ,F A L L 一3 9 L y s 3 2 ,F A L L 3 9 L y s 2 4 3 2 S e m i q u 舳t i t a t i v er e v e r s e t r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i n 陀a c t i o n ( R T P C R ) w 鹳u dt od e t e m i n et h eF A L L - 3 9a n di N O Sm R N Ae x p r e s s i o n N Oc o n t e n tw a sd e t e c t e db yu s
8、i n gn i t r a t er e d u c t a 啪t l l o d 1 1 1 ee n d o t o x i m am o d e li nB A L B CI I l i c ew 酗c r e a t e d b yu s i n gU ) sa n da c t i n o m y c i nD r 1 1 l eI I l i c e w e r et r e a t e dw i t ht l l ep e p t i d e sa n dN Oc o n t e n ti ns e m mw 鹊d e t e c t e d R e s u l 缸T h eF
9、 A L L - 3 9a n d i N O Sm R N Ae x p r e s s i o nw e r ei n c r e 鹤e di n d u c e db yU ) s F A L L - 3 9a n di tm u t a n tp e t i d e si n h i b i t e dt h ei n d u c e dn i t r i co x i d es y n t h a s e ( i N O S ) m R N Ae x p r e s s i o na n dt h ep r o d u c t i o no fN Oi n m P 一1c e l l
10、 s A m o n g t l l e m F A L L 3 9 L y s 2 4 3 2h a dt l em o s tp o t e n t i a le 虢c t C o n c l u s i o n A n t i b a c t e r i a L lp e p t i d eF A L L - 3 9 A n di t sm u t a n t p e t i d e sh a v ea n t i e n d o t o 】【i ne f f e c t , a I l dt l l i se f k c ti sa s s o c i a t e d w i t hi
11、 n h i b i t o no fi N O S m R N Ae x p r e s s i o na n dN Op m d u c t i o n K e yw o r l s a n t i b a c t e r i a lp e p t i d e ; F A L L 3 9 ; m u t a t i o n ; n i t r i co x i d e I n tJP a t l l o lc l i nM e d ,2 0 0 8 ,2 8 ( 6 ) :0 4 6 1 D 4 】 收稿日期:2 0 0 8 一0 9 0 4修回日期:2 0 0 8 一l l l l 作者
12、简介:郝杰( 1 9 8 3 ) ,女,山西太原人,硕士研究生,主要从事抗炎免疫药理学研究。 通讯作者:杨云霞,E m a i l :j a c q u e s i M c o m 基金项目:国家自然科学基金( 3 9 6 7 0 6 8 3 ) 珏i sw o r kw 鼬p p o n e db yN a t i a lN 越u r a iS c i e m eF 0 u n d m i mo f C h i m ( 3 9 6 7 0 6 8 3 ) 4 6 l 万方数据 第6 期 国际病理科学与临床杂志 第2 8 卷 内源性抗菌肽( e n d o g e n o u sa n t i
13、 b i o t i cp e p t i d e s ,简 称抗菌肽) 被认为是机体在进化过程中产生的广泛 存在的免疫活性分子。抗菌肽是由基因编码,具有 广谱抗微生物活性,有的还具有抗内毒素作用。 人类抗菌肽主要有防御素家族和C a t h e l i c i d i n 家族蛋白,其中C a t h e l i c i d i n 家族蛋白是新近发现的 一组抗菌肽家族,其家族成员均具有高度保守的信 号序列和C a t h e l i n 样区,以及各种各样的C 末端抗 菌功能域,因此称之为c a t h e l i c i d i n 家族 1 。人类第 1 个c a t h e l i
14、c i d i n 是从人骨髓文库中分离出的c D N A 的开放阅读框推测出来的,因其N 端最初的4 个氨 基酸分别为F - A L - L ,全长有3 9 个氨基酸而命名为 F A L L - 3 9 ,以后分离获得的天然肽分子N 端开始的 F A 两个氨基酸残基缺如,因此称为L L - 3 7 ,二者的 功能完全相同心J 。F A L L 一3 9 基因分布广泛,其抗菌 谱较广,但抗菌活性一般;同时具有一定的抗内毒素 作用。 N o 是一氧化氮合酶( n i t r i co x i d es y n t h a s e , N O S ) 分解底物精氨酸的产物。有原生型( c N O
15、S ) 和 诱生型( i N O s ) 两种。通常在病理情况下由内毒素 和或细胞因子( T N F ,I L 一1 ,I F N 一1 等) 刺激,激活 i N O S 而合成大量的N O ,在炎症局部可发挥抗炎和 杀菌等保护性作用,而全身性的大量释放的N O 则 参与机体炎症反应和感染、创伤引起的器官功能损 害。笔者前期已经提纯并纯化人抗菌肽F A L L - 3 9 以 及突变肽F A L L 一3 9 一L y s 2 4 ( 天然肽第2 4 位碱基由碱 性赖氨酸替代中性谷氨酰胺) 、F A L L 3 9 一L y s 3 2 ( 第 3 2 位碱基由赖氨酸替代中性天门冬氨酸) 、F
16、 A L L 一 3 9 一L y s 2 4 3 2 ( 第2 4 ,3 2 位同时用赖氨酸替代) ,发现 突变肽可以增强抗菌活性圳,本研究在此基础上探 讨其对细菌内毒素介导的人单核吞噬细胞T H P l 的 N O 产生的影响。 1 材料与方法 1 1 主要试剂及动物人抗菌肽F A L L - 3 9 以及 突变肽F A L L 3 9 L y s 2 4 ,F A L L - 3 9 一L y s 3 2 ,F A L L 一3 9 - L y s 2 4 3 2 由本室纯化。人单核细胞系T H P l ,为四 川大学华西医学中心感染与免疫研究室惠赠。细胞 完全培养基:9 0 R P M
17、 l l 6 4 0 、1 0 胎牛血清、 4m o L L 谷氨酰胺、1 0 0m L 硫酸链霉素、1 0 0U m L 青霉素G 钠。细菌脂多糖( L P s ) 、放线菌素D ( a c t i - n o m y c i nD ,A M D ) 为美国S i 鲫公司产品;其它试剂 均为国产分析纯。B A L B c 小鼠4 8 只,雌雄各半,体 质量( 2 0 2 ) g ,由四川大学华西实验动物中心提供。 1 2方法 1 2 1 引物设计根据G e n b a n k 人抗菌肽 F A L L - 3 9c D N A 序列( 登录号:X 9 6 7 3 5 ) 设计特异引 物,正义
18、:5 一A A C G G A r C C r 丌G C C C T G C T G - 3 ;反义: 5 C C A G G A T C C G G C A C A C A C T A G - 3 。根据 G e n - B a n k 人i N O Sc D N A 序列设计特异引物( 基因登录 号:D 2 6 5 2 5 ) ,正义:5 - C T G G A l G T C G I 姒C m T A G A T T 3 :反义:5 - A T G T A C C C T C G G ,I - I T G C G - 3 。 内参照B a c t i n 特异引物序列分别为,正义:5 一
19、A G G T - G A G A G G G A A A T C G T G C G - 3 ;反义: 57 - G 1 、G C A C - c A G A c A G C A c T C 爪X - 3 。引物均由G i b c o 公司合成。 1 2 2细胞F A L L _ 3 9m R N A 的表达 参照文献 5 的方法做悬浮培养细胞的刺激实验。取1 5 1 0 6 个T H P - 1 细胞接种于6 孔板中,在3 7 ,5 C O ,条件下培养2 4h 。加入不同剂量的L P S ( 2 5 , 2 5n m L ) ,继续培养8h 后分别提取总R N A ,用 R T P c
20、R 方法检测F A L L - 3 9m R N A 的表达量,同时用 B a c t i n 作为内对照。 1 2 3细胞i N O Sm R N A 的表达 做悬浮培养细 胞的刺激实验。取1 5 1 0 6 个T H P - 1 细胞接种于6 孔板中,在3 7 ,5 C O :条件下培养2 4h 。加入 2 5n g m L 的L P s ,以及人抗菌肽F A L L 3 9 以及突变 肽F A L L 一3 9 一L y s 2 4 ,F A L L 一3 9 - L y s 3 2 ,F A L L 一3 9 L y s 2 4 3 2 ( 浓度均为2 5 恤g m L ) ,继续培养
21、8h 后分别提取 总R N A 。用R T - P C R 方法检测i N O Sm R N A 的表达 量,计算机进行灰度扫描,同时用B a c t i n 作为内对 照,计算i N o sm R N A 的相对表达量。 1 2 4 细胞培养上清液N O 含量测定取对数 生长期T H P 一1 细胞,以2 1 0 5 L 密度接种于9 6 孔 培养板中,每组设3 个平行孔。分为空白对照细胞 组、L P s ( 2 5n g m L ) 处理细胞组、抗菌肽F A L L - 3 9 以 及突变肽F A L L - 3 9 一L y s 2 4 ,F A L L 一3 9 - L y s 3 2
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 抗菌 FALL39 及其 突变 诱生型 一氧化氮 产生 影响
链接地址:https://www.31doc.com/p-3713101.html