热休克蛋白27在大鼠脊髓前角中的表达.pdf
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1、主 里 盆炭工业医学杂志2 0 0 4 年1 月 第7 卷 第I 期 基础论著 文章编号1 0 0 7 一 9 5 6 4 ( 2 0 0 4 ) 0 1 一 0 0 7 9 一 0 2 热休克蛋白2 7 在大鼠脊髓前角中的表达 0 6 3 0 0 0 河北省唐山市, 华北煤炭医学院解剖教研室 刘奕蓉 吴建中 支 哗 唐山市第二医院赵国志 关键词热休克蛋白2 7 ; 热休克 反应; 免疲组织化学; 大鼠 中图分类号 R一 3 3 2文献标识码 A 热休克蛋白( h e a t s h o c k p r o t e i n s , H s p s ) 是一组被广泛关注 的蛋白质, 它是机体或离
2、体培养的细胞暴露在较高温度下( 约 高出正常生理温度4 - 6 C ) , 并持续一段时间后, 机体/ 细胞产 生的一种特殊蛋白质( 现已证实, 除热以外其他许多因素均可 诱导热休克蛋白产生) , 它能保护机体或细胞不受或少受伤害。 热休克蛋白在结构上高度保守, 它广泛存在于从原核生物到真 核生物的整个自 然界。热休克蛋白家族的成员众多, 根据其分 子量的大小分为五类。其中, 热休克蛋白2 7 ( H s p 2 7 ) 属于小分 子量家族, 目 前的研究证明, H s p 2 7 是 p 3 8 促分裂素蛋白激酶 ( 闪8 M A P K ) 代谢的终末产物, l i s p 2 7 主要参
3、与微丝的稳定和 细胞信号转导, H s p 2 7 能阻止应激状态的肌动蛋白和微丝的分 裂, 有利于细胞骨架的稳定。它不仅对单个细胞产生应激耐受 起重要作用, 而且通过内皮和上皮的屏障作用, 对整个有机体 起必要的保护作用。由于热休克反应代表了一种基本的细胞 保护机制, 环境温度改变及体温升高又为机体所经常遇到, 因 而对整体动物的研究更具实用意义, 但很少见报道。我们用免 疫组织化学的方法结合图像分析技术, 研究了高温诱导大鼠脊 髓前角H s p 2 7 的表达及动态变化。 1 材料与方法 1 . 1 实验动物及热休克处理健康雄性 Wi s t a r 大鼠( 体重 2 0 0 - 2 5
4、0 g , 购自 北京大学医学部实验动物中心) 6 0只。随机 分为对照组和实验组。对实验动物作如下处理: 对照组动 物不作任何处理直接麻醉后经心脏灌注4 %多聚甲醛固定液 处死。实验组动物经 1 %的戊巴比妥钠( 4 0 m 岁k g ) 溶液腹 腔注射麻醉后, 置于4 5 水浴箱中, 直至其肛温达到4 2 后 维持 1 5 min , 再转移至4 2 水浴箱中继续维持2 0 m i n , 然后置 室温恢复( 预处理期间, 动物腹腔内注射5 一 8 m 1 3 7 生理盐 水, 以防止动物脱水) 。 1 . 2 标本制备实验组动物经热休克预处理后, 分别置于室 温恢复1 2 h , 1 ,
5、 3 , 5 , 7 d 5 个时间点( 每时间点6只) , 将实验动 物以1 %戊巴比妥钠( 4 0 m g / k g ) 麻醉, 经左心室向升主动脉内 插管灌注4 %多聚甲醛固定液处死动物。取大鼠脊髓C s - - T , 节段, 置于相同固定液内后固定4 h , 转人3 0 %蔗糖溶液中置 4 冰箱中过夜至组织沉底。冰冻切片机切片, 片厚4 0 p m , 相 邻切片分为4 组备用。 1 . 3 免疫组织化学染色按链霉亲和素一过氧化物酶 ( s t r e p t a v i d i n 一 p e r o x i d a s e , S P ) 法进行。甲醇一 0 . 3 %姚仇 阻
6、 断内 源性过氧化物酶; 一抗( 兔抗大鼠H s p 2 7 , 1 : 2 0 0 武汉博士 德产品) 4 C孵育2 4 h ; 二抗( 羊抗兔I g G , 1 : 2 0 0 , 武汉博士德产 品) 3 7 C孵育 l h ; 链霉亲和素一辣根过氧化物酶复合物( 1 : 2 0 0 ) 3 7 C孵育3 0 m i n o D A B显色, 常规封片。以P B S 替代一 抗作阴性对照。 1 . 4 图像分析采用 C MI A S 一真彩色医学图像分析系统 ( 由北京航空航天大学提供) , 进行脊髓前角细胞计数和阳性 细胞染色强度测定。 1 . 5 统计学处理 各组的图像分析结果均进行方
7、差分析, 4 检验, 数据以( 牙士 : ) 表示。 2 结果 2 . 1 正常对照组 H s p 2 7 免疫组化染色结果显示, 在脊髓几 一 T t 节段有少量H s p 2 7 , 主要分布在灰质, 胞浆/ 胞核为淡黄 色。 表1 不同时间点脊髓前角H s p 2 7 阳性神经元数目及平均光密度值( O D ) ( x1 s , n = 6 ) 组别1 2 h 实验组阳性神经元数1 6 . 3 4 0士2 . 3 6 0. 2 0. 7 5 0士4. 5 9 0 “ “ 1 7 . 5 1 0士2 . 3 9 0“ “1 5 . 4 7 0士4 . 1 0 0. “ 1 2 . 1 9
8、0士2 . 9 1 0 0 . 1 3 0士0 . 0 1 2“ “0 . 2 1 2士0 . 0 3 4 甘0 士0 . 0 2 1 “ 0 . 1 1 8士0 . 0 1 4 “ 0 . 1 0 2 士0 . 0 1 2 对照组阳性神经元数8 . 2 7 0士1 . 8 1 01 2 . 3 1 0士2 . 0 6 0 1 2 6 6 5 0土1 . 2 8 0 8 . 0 1 0 1 1 . 4 7 0 7 . 6 9 0士1 . 0 4 0 0 . 0 8 2士0 . 0 1 1 0. 1 5 7土0. 0 2 40 . 1 0 6土0 . 0 1 3 0 . 0 8 9士0 . 0
9、1 0( ) . 0 7 5士0 . 0 1 2 注: 与对照组比较 P0 . 0 5 , - - P0 . 0 1 2 . 2 热休克预处理组本组分别从1 2 h , 1 , 3 , 5 , 7 d 等几个时 间点观察H s p 2 7 的表达情况。预热处理1 2 h 后, 脊髓灰、 白质 均有大量H s p 2 7 表达, 在灰质的神经元内棕黄色颗粒主要位 于胞核, 胞浆无染色。预热处理 I d后, 前角细胞胞体较正常 对照组略肿胀, 胞浆、 胞核均呈棕褐色浓染, 细胞轮廓清晰, 3 d 时胞核染色仍较深, 而胞浆染色逐渐变浅, 细胞轮廓较清晰, 同时阳性细胞数较 I d有所减少。5 d时
10、胞浆染色基本褪去, 胞核染色较深, 呈棕黄色。到7 d 胞核染色逐渐变浅, 胞浆淡 染, 细胞轮廓不清晰, 阳性细胞数进一步减少。热休克预处理 后 2 “ 一 7 d , 脊 髓 灰 质 均 有 不 同 程 度 的 H s p 2 7 表 达 , 以 预 热 后 I d 为表达高峰。在热休克之后, 热休克蛋白有一个从胞核到 胞浆的迁移过程。而恢复期又从胞浆移人胞核。 万方数据 gj in e s e 一 J o u rn a l o f C o a l I n d u s t ry Me d ic i n e J a n u a r y 2 0 0 4 , V o l . 7 , N o .
11、1 计算机图象分析结果显示: 热休克预处理后, 脊髓H s p 2 7 的阳性细胞数明显增加, 预处理后I d 阳性细胞数为( 2 0 . 7 5 士 4 . 5 9 ) , 数量最多, 与正常对照组比较差异有高度显著性( P 0 . 0 1 ) . 3 d 后开始逐渐减少, 至7 d阳性细胞数为( 1 2 . 1 9 1 2 . 9 1 ) 。预热处理后, 阳性细胞染色迅速加强, 平均O D值增 高, I d最明显, 与正常对照组比较差异有高度显著性( P 0 . 0 1 ) , 此后, 染色逐渐减低。 3 讨论 目前的研究表明, 在生理状态下, 小分子热休克蛋白在一 些组织、 器官有强度不
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- 休克 蛋白 27 大鼠 脊髓 中的 表达
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