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1、文章编号: 1000 - 0615 (2006) 04 - 0525 - 06 收稿日期: 2005-12-08 资助项目: 中国水产科学研究院科研基金项目 (2001 - 2 - 7) 作者简介: 杨鸢 (1963 - ) , 女, 江苏无锡人, 助理研究员, 从事水生动物病害防治研究。E-mail:yangyj 暗纹东方非 01 霍乱弧菌的鉴定及毒力基因检测 杨鸢 1, 俞菊华1,陈辉2, 方苹2, 郭闯2 (1.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心, 江苏 无锡214081; 2.江苏省水产技术推广站, 江苏 南京210036) 摘要: 在对养殖暗纹东方病害调查中, 从呈典型症状病鱼腹腔
2、和肠道粘液中分离到 2 株 (J - 1 和 H - 3) 菌株, 经生化特性和血清型鉴定为非 01 群霍乱弧菌 (Non - 01 Vibrio cholerae) 。注射、 创伤和浸泡 3 种方式进行人工感 染试验表现出较强的致病性, 出现症状与自然发病鱼相同。为进一步确认分离菌株的分类地位, 使用 P1、 P2 引 物, 以非 01 群霍乱弧菌 N92001 菌株和 01 群霍乱弧菌 N16961 菌株为对照, 对分离菌株进行 PCR 扩增, 得到 451bp 的 DNA 片段。根据现有霍乱弧菌肠毒素 ctxA 基因序列设计引物 P3, P4, 以 N16961 菌株为阳性对照, PCR
3、 扩增结果均得到大小为 400 bp 的 DNA 片段。在对 H - 3 菌株的扩增片段进行纯化、 克隆和测序, 得到 407bp 序 列, 该菌株与 N16961 菌株中肠毒素 ctxA 基因序列的完全一致, 证实该片段源于 ctxA 基因。进一步说明从暗纹 东方体内分离到的 J - 1 和 H - 3 菌株具有霍乱肠毒素 ctxA, 有一定的致病力。 关键词: 暗纹东方; 非 01 群霍乱弧菌; 肠毒素 ctxA 中图分类号: Q 959.483;S 917文献标识码: A Separation and determination on virulence genes of Vibrio
4、cholerae in Fugu obscurus YANG Yuan-jie1,YU Ju-Hua1,CHEN Hui2,FANG Ping2,GUO Chuang2 (1. Freshwater Fisheries Research Centre,Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuxi214081, China; 2. Jiangsu Provincial Aquatic Technology Extension Station,Nanjing210036,China) Abstract:During the survey on diseases
5、 of Fugu obscurus from 2002 to 2004,two strains (J - 1 and H - 3)of pathogenic bacteria with typical symptoms were isolated from abdominal cavity and intestinal mucus of suffering Fugu obscurus . The two isolated strains were identified as non-01strains of Vibrio cholerae through biochemical test an
6、d serotype identification. It could be inferred that they are pathogens of bacterial enteritis of Fugu obscurus since the results of artificial infection are the same as the natural infection. In order to testify the classification of the isolated strains,the isolated strains were amplified by polym
7、erase chain reaction (PCR)with two primers designed according to the sequence of Vibrio . The PCR products were DNA sequence of 451 bp. The result showed that systematic status between J - 1,H - 3 and N92001,N16961 was close. Enterotoxin with active subunit A named ctxA is one of the primary infecti
8、on agents of Vibrio cholerae . While the pathogenicity is related with ctxA,the test of gene of enterotoxin is the most important step of diagnosis. Using N16961 strains as positive control,the same PCR DNA sequence of 400 bp was obtained in the PCR analysis. By sequencing and alignment,this 407 bp
9、sequence of H - 3 strains is identical with ctxA,which indicated that J - 1 strains and H - 3 strains were the pathogenic bacteria of F . obscurus . Bacterial diseases are common and frequent in process of aquaculture especially the intensive aquiculture. This paper shows introduces how to combine c
10、ommon method and PCR to isolate, 第 30 卷第 4 期 2006 年 8 月 水产学报 JOURNAL OF FISHERIES OF CHINA Pol.30,No.4 Aug.,2006 identify and study bacteria. The pollution of non-01strains of V cholerae in aquatic product reflects in some way the degree of environmental pollution. Thus the study of pathogenicity is
11、 meaningful to evaluate if bacteria would cause disease and to limit its prevalence,so as to study and control the zoonosis. Key words: Fugu obscurus;non - 01 Vibrio cholerae;enterotoxin ctxA 暗纹东方 (Fugu obscurus Abe) 作为一种名贵 养殖鱼类, 近年来因其特有的品质受到人们的重 视。在大规模养殖过程中, 由于各种疾病不断出 现, 特别是细菌性疾病暴发流行, 给河养殖业造 成了一定的经
12、济损失。2002 - 2004 年我们对江苏 省太仓、 姜堰、 海安等地暗纹东方养殖场的发病 情况进行了调查, 对病症为细菌性肠炎的河进 行了病原菌的分离鉴定。从发病河腹腔和肠道 粘液中分离到 2 株 (J - 1 和 H - 3) 具有典型特症 的菌株, 经生化特性和血清型鉴定为非 01 群霍乱 弧菌 (non - 01 Vibrio cholerae) 。为进一步鉴定病 原菌及其致病性, 笔者采用不同的感染方法对河 进行人工感染试验, 其主要发病症状为肠壁呈 水肿状, 充血发炎, 并产生淡黄色粘液。采用 PCR 法扩增特异性基因片段进行检测, 结果表明分离 菌株含有霍乱肠毒素基因 ctxA
13、。由此证实该菌株 对暗纹东方具有一定的致病性。这对了解非 01 群霍乱弧菌菌株的致病性并控制其传播和流行, 以及对养殖鱼类的致病菌检测、 人畜共患疾病的 研究和控制都具有重要的意义。 1材料与方法 1.1材料 实验用鱼患病暗纹东方分别取自江 苏省太仓、 姜堰、 海安等地暗纹东方养殖场; 健 康暗纹东方选自江苏省中洋水产集团公司, 体 重 (21 3) g, 将暗纹东方置于水族箱中暂养。 水族箱大小为: 100 cm 60 cm 50 cm, 水深: 30 cm; 水温控制在 (25 2)B, CD 5 mg E - 1 , pH 7.0 8.0, 用空气泵充气增氧。暂养时投喂复合 饵料, 实验
14、时不投饵料。 试剂和培养基碱性蛋白胨水培养基、 碱 性琼脂培养基、 TCFG 琼脂培养基、 营养琼脂培养 基、 微量生化鉴定管, 购自浙江省军区后勤部卫生 防疫检验所; 诊断血清, 购于江苏省疾病控制中 心;Taq 酶、 蛋白酶 H、 dITPs 、 CIA JarKer, 为上 海申能博彩生物工程技术公司产品; 胶回收试剂 盒、 pCLm-T, 购自上海生物工程有限公司; TM 缓 冲液 (pH 8.0) 、 GCG 等实验试剂由实验室配制。 霍乱弧菌对照菌株非 01 群霍乱弧菌 I92001 菌株, 购自江苏省疾病控制中心; 01 群霍 乱弧菌肠 I16961 菌株染色体 (美国马里兰大学
15、) , 由中国疾病预防控制中心传染病预防控制研究所 馈赠。 1.2人工感染试验 将已鉴定的 2 株 (J - 1 和 H - 3) 菌株进行 35 B培养 24 h, 斜面培养物用无菌生理盐水洗下, Censimat 浊度计比浊, 稀释菌液浓度至 0.5 CNL mE - 1备用。选择实验室暂养 1 周以上无病症的 健康暗纹东方, 随机分为 6 组, 每组 7 尾, 同时 设平行组, 分别进行注射感染、 创伤感染和浸泡感 染, 连续观察 14 d。 注射感染在鱼体胸鳍基部注射 0.5 mE、 浓度为 0.5 CNL mE - 1溶液; 对照组注射 0.5 mE 10O无菌生理盐水。 创伤感染将
16、试验鱼体表刮伤, 置菌液浓 度为 2.0 105CNL mE - 1水体中; 对照组为体表 受伤鱼置于曝气自来水中。 浸泡感染将体表无损伤实验鱼置菌液 浓度为 2.0 105CNL mE - 1水体中; 将对照组实 验鱼置于曝气自来水中。 1.3细菌生化分离鉴定 现场采集具有典型病症的暗纹东方, 无菌 蒸馏水冲洗体表。灭菌吸管分别取肠道和腹腔粘 液于碱性蛋白胨水培养液中, 35 B培养 18 h; 将培 养物分别接种于碱性琼脂和 TCFG 琼脂平皿, 35 B 24 h 培养后进行观察; 选取优势单菌落培养物 接种于营养琼脂斜面, 经 35 B 24 h 培养后, 4 B 保存备用。按照 一般
17、细菌常用鉴定方法 1进行 生理生化试验。根据 伯杰氏细菌鉴定手册 2将 分离菌株鉴定到属。 1.4分子生物学鉴定 细菌 CIA 抽提选取生长良好的单菌落 接种营养肉汤培养基, 置 37 B 摇床振荡培养 24 h, 收获细菌; 加 TM 缓冲液 467E、 10O GCG 30 E、 20 mg mE - 1蛋白酶 H 3 E, 55 B温育 1 h; 用 625 水产学报30 卷 等体积酚 - 氯仿抽提, 转移上层水相 (重复 2 次) ; 加 1!10 体积醋酸钠, 轻轻混匀; 加 2 倍体积无水 乙醇, 置 - 20 “沉淀; 使用前离心, 70# 乙醇洗涤 两次, 55 “烘干; 20
18、$ %,%4, 94 “ 1 64, 55 “ 1 64, 72 “ 1 64 , 扩 增 30 个循环, 72 “ 延伸 10 64, 4 “ 保存。() 产物于 250#琼脂糖凝胶电泳检测。纯化以 ? - 3 菌株为模板, 引物 3、 4 扩增的片段, 用胶回收试 剂盒纯化, 克隆到 =(6 - % 载体中, 送上海申能 博彩生物工程技术公司测序。 序列分析及数据处理利用 A8B?黄黄黄黄 氧化酶 x+A0., BBBB CD x+A0t+1 :,/-,1t0t+81DDDD 动力 -t+6+tE BBBB 斜面 .601t 2222 高层 F;tt BBBB 气体 90. 2222 *5
19、?2222 0G154 (每片 109)A+.H? 0G154 (每片 1I0g)A+.H? 0(N0=6BBBB 3(N0=6BBBB J(N0=6( B )BBB K(N0=62222 硝酸盐还原 1+t/0t, /,cL,/EBB BB 吲哚试验 +1A6, 8/A;ct+1B BBB MN L9,. 8/.H0;,/222A 赖氨酸脱羧酶 6E.+1, A,c0/FxE60.,BB BB 鸟氨酸脱羧酶 /1+t7+1, ,c0/FxE60.,BB BB 精氨酸脱羧酶 0/9+1+1,2 222 脲酶 ;/,0., ( B )B( B )2 葡萄糖 96;c., BBBB 蔗糖 .;c/
20、., BB2B 阿拉伯糖 0/0F+1.,2 222 鼠李糖 /70-1., 2222 乳糖 60ct., 22( B )2 甘露糖 -011+t6 BBBA 麦芽糖 -06t., B BBB 水杨苷 .06+c+1 2222 甘露醇 -011., BBBB 肌醇 +1.+t6 2222 山梨醇 ./F+t6 222NO CNNP 反应 CNNP t,.tBBBB C1 群抗血清凝集 0996;t+10t,A FE c76,/0 01 01t+.,/;- 222A 0134 诊断血清 0134 F6A .,/;- A+091.+. 2222 注:“*” : 伯杰氏细菌鉴定手册中对霍乱弧菌描述;
21、“ B ” : 阳性;“ 2 ” : 阴性;“D” : 发酵;“?” : 抑菌;“ ( B ) ” : 反应迟缓;“A” : 多于 10( 菌 株阳性或阴性;“NO” : 表示手册中没有记载 Nt,.: “*” : ,/9,E . -01;06 : A,t,/-+10t+/, F0ct,/+69E; ” B ” : N.+t+L,Q“ 2 ” : N,90t+L,; “D” : D,/-,1t;“?” : ?;88/, t7, F0ct,/+;-; “ ( B ) ” : R,60E,A /,.81.,;“A” : S/, t701 10( F0ct,/+;- .t/0+1. 0/, 8.+t
22、+L, / 1,90t+L,;“NO” : N -,1t+1 +1 t7, -01;06 825 水产学报30 卷 图 1 16S rRNA PCR 结果 Fig.1The results of 16S rRNA amplification M: DL1? MarAer; 1: B C 1 菌株; D: E C F 菌株; F: NGD1 菌株; H: N16G61 菌株 M: DL1? MarAer;1: B C 1 strain; D: E C F strain; F: NGD1 strain; H: N16G61 strain 图 D ctIA 基因 PCR 扩增结果 Fig.DThe
23、results of ctIA gene amplification M: DL1? MarAer; 1: B C 1 菌株 ctIA 基因产物; D: E C F 菌株 ctIA 基因产物; F: N16G61 菌株 ctIA 基因产物 M: DL1? MarAer; 1: B C 1 strain cultureJ of ctIA gene proJucts; D: E C F strain cultureJ of ctIA gene proJucts; F: N16G61 strain cultureJ of ctIA gene proJucts 图 F E C F 菌株 ctIA 基因
24、序列与 1 群霍乱弧菌 N16G61 菌株 ctIA 基因序列的比较 Fig.FAlignmont of ctIA gene from KiLrio cholerae E C F strain anJ N16G61 strain 925 4 期 杨鸢等: 暗纹东方非 01 霍乱弧菌的鉴定及毒力基因检测 3讨论 霍乱弧菌的主要致病因子之一是霍乱肠毒 素 3, 它由一个 A 亚单位基因和 # 个 $ 亚单位基 因组成的多聚体。A 亚单位为具有毒性的单位, 是毒素的活性部份, 它能激活肠细胞的腺苷酸环 化酶; $ 亚单位为结合单位, 是毒素的抗原部分, 它将 毒素 结合至肠上皮细胞 的 受 体 神
25、经 苷 脂 %*7* 染色体! 参考文献: 中国科学院微生物研究所细菌分类组 9 一般细菌常用鉴定 方法 ,9 伯杰氏细菌鉴定手册 (第八版) A J?NBIB AT PHA4AH34L PIL LKB4IOJB4KE?ABIBC 9 APP? ,OIEA &I3EAUI?, 7779*# (+) : 87(8 R 87(*9 7 郑国兴 9养殖对虾弧菌致病菌 R 非 ) 群霍乱弧菌的生物学 性状与致病性 C 9水产学报, 76*, ) (8) : 7# R 8)39 ) 樊海平, 黄晓风, 徐娟儿 9 养殖欧洲鳗鲡脱粘病的研究 C 9 中国水产科学, 776, # (8) : *6 R +89 陈爱贞, 蔡戴崧, 朱素仪, 等 9 佛山市外环境水体非 ) 霍乱 弧菌生物学特性和流行病学研究 C 9 中华预防医学杂志, 8)(, 36 () : (+ R (79 8 于兵, 麻丽丹, 李劲革, 等 9 丹东口岸国境外环境水体中 检出 )37 群霍乱弧菌 C 9中国国境卫生检疫杂志, 8)(, 8+ (() : 8)( R 8)#9 3 陈学军, 谢昭聪, 何建凡 9水体及水产品霍乱弧菌疫源监测 研究 C 9实用预防医学, 8)8, 7 () : *7 R +)9 035 水产学报30 卷
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