构建组织工程化人工食管模型的实验研究.pdf
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1、山东医药 2 0 0 6 年第 4 6 卷第2 7 期 构建组织工程化人工食管模型的实验研究 张哲 , 牛晓光2 , 高松3 , 张强3 , 张 ( 1 青岛市市立医院, 山东青岛2 6 6 0 1 1 璐z ; 2泰安市中心医院; 3泰山医学院附属医院) 摘要 用曲拉通X - 1 0 0 将猪主动脉进行脱细胞处理。将体外扩增培养的犬新生食管上皮细胞接种于猪脱 细胞血管基质( A C T M) 上, 通过光镜及扫描电镜观察A C T M是否存在细胞成分以及食管戮膜上皮细胞能否生长 于其上。 结果: 酶化学除垢剂法能使猪主动脉细胞脱落, 基质三维结构变疏松。 体外扩增的犬食管猫膜上皮细胞可 以种
2、植在猪A C T M上并能生长增殖。 认为猪A C T M与犬食管上皮细胞具有良 好的生物相容性, 能结合形成人工 食管移植体。 关键词 组织工程; 人工器官; 食管 中图分类号 R 3 1 8 - 1 4 文献标识码 B 文章编号 1 0 0 2 - 2 6 6 X ( 2 0 0 6 ) 2 7 - 0 0 2 5 - 0 2 食管癌根治术中多采用自体胃、 结肠、 小肠等替 代食管, 手术创伤大, 术后易造成消化功能紊乱和吸 收功能障碍。用无细胞支架人工食管由于上皮替代 时间长( 约 3 - 4 个月) , 薪膜下结构及肌层增生不 良, 术后吻合口痰发生率较高, 并易形成狭窄, 失败 率高
3、。近年来组织工程技术的发展为人工食管的研 究开辟了新的思路。2 0 0 4 年 4 月一1 1 月, 我们应用 体外培养的犬食管豁膜上皮细胞移植在脱细胞的猪 主动脉基质支架上, 构建组织工程化人工食管模型。 现报告如下。 1 材料与方法 1 . 1 主要材料新生幼犬( 泰山医学院实验动物 园) , D i s p a s e I 、 II 型胶原酶( G i b c o 公司) 。 1 . 2 食管赫膜上皮细胞的制备无菌条件下取处 死后的幼犬( 出生 2 4 h内) 食管 3 -4 c m, 沿纵轴切 开, 剔除豁膜下组织。0 . 0 5 %洗必泰浸泡 3 -5 m i n 后, 在 4 双抗
4、P B S液中浸泡 2 h ( 含青霉素 1 0 0 I U/ m l , 链霉素l o o ji g / m l ) 。 根据文献 1 12 进行细胞培养。 1 . 3 脱细胞猪主动脉的制备取体质量为8 0 - 1 0 0 k g的家猪主动脉, 保存于4D - H a n k s 平衡盐溶 液中, 热缺血时间 1 0 m i n , 剥去血管外膜后浸泡于 1 %新洁尔灭中3 0 m i n , P B S 彻底冲洗。 参照文献 3 , 用由拉通 X - 1 0 0 进行脱细胞处理后, 用 P B S反复冲 洗制成脱细胞血管基质( A C T M ) , 保存于 4 含 C a 2 + , M
5、 g t + 的D - H a n k s 平衡盐溶液中。 备检。 1 . 4 细胞种植将A C T M支架无菌条件下剪成直 径约 1 . 5 c m的小块, 置 2 4 孔培养板上, 紫外线灯照 2 4 h , 使其微干, 在其内膜面滴人胎牛血清 1 -2 滴, 基金项目 山东省卫生科技发展计划资助项 目( J Z 4 4 ) . 置3 7 C , 5 % C O : 培养箱中孵育2 h 。将食管戮膜上 皮细胞用0 . 0 5 0 o 胰蛋白酶消化2 -3 m i n , 离心5 m i n ( 1 0 0 0 r / m i n ) , 用D ME M漂洗3 次, 用D ME M调整 细胞
6、密度至 5 X 1 0 6 / m l , 种植于预先放有 A C T M 的 2 4 孔板中, 置 3 7 C, 5 0 o C O , 培养箱中孵育, 1 2 h后 换液, 以后每 2 -3 d 换液 1 次, 于种植后第 3 , 7 天取 材, 行H E染色和电镜观察。 2 结果 2 . 1 细胞形态学观察显微镜下, 原代食管上皮豁 膜细胞经 6 -8 h培养后形态不规则, 呈椭圆形或圆 形, 大部分细胞贴壁, 并形成细胞集落, 5 - v 6 d 后, 细 胞汇合成单层, 呈现典型的铺路石样排列。 2 . 2 A C T M观察结果经脱细胞处理后, 血管壁呈 现乳白色半透明状, 管壁变
7、薄, 管腔略塌陷, 内膜光 滑, 弹性良好。 随机切取8 块组织样本, H E染色未见 蓝染核物质和细胞碎片残留, 内膜层呈透明状, 弹力 纤维染色可见弹力纤维排列规整, 其间可见有散在 的胶原存在。扫描电镜观察未见细胞结构, 只存留胶 原、 弹力纤维和少量变性线粒体, 细胞外基质( E C M) 纤维粗细不等, 交织排列, 孔隙2 0 -1 0 0 u m , 2 . 3 细胞种植后组织学检查体外培养 3 d后在基 质内膜表面可见有不连续蓝紫染色的细胞, 7 d 后在 基质支架上形成单细胞层。透射电镜观察可见胞质 内有张力原纤维, 细胞表面可见大量微绒毛, 细胞间 可见桥粒和半桥粒。 3 讨
8、论 高分子聚合材料存在结构及成分上的单一性, 无法提供适合不同细胞同时生长的E C M 及超微结 构。 细胞与E C M的豁附及相互作用是细胞生长增殖 的基础E 4 。研究发现 I 型胶原主要存在于食管的豁 膜下和肌层内, 1 型胶原主要存在于食管的外膜弹 2 5 山东医药 2 0 0 6 年第 4 6 卷第 2 7 期 力纤维层和豁膜下1 5 1 。 有实验表明E 6 1 , 经脱细胞处理, 犬颈动脉组织中的细胞及可溶性的蛋白质成分脱 失, 外观保留完整, 组织学和超微形态的结构被保 留, 其主要成分为 I , 1型胶原和弹性蛋白等, 与正 常的E C M 成分相似, 具有极低的免疫原性。2
9、 0 0 0 年, 有人分别用A C T M, S I S ( 小肠戮膜下层) 修复猪 膀胧和犬食管缺损均获得成功, 证实A C T M具有良 好的生物相容性, 有利于上皮细胞的生长E 7 1 。 本研究 中, 我们采用了猪主动脉脱细胞基质支架作为食管 赫膜上皮细胞的种植地, 结果表明A C T M支架不仅 来源丰富、 制备过程简单, 且由于基本保留了E C M 的主要成分和结构, 适于食管戮膜上皮细胞生长及 增殖。因此认为, 猪主动脉脱细胞基质支架可以作为 组织工程化人工食管的基质支架。 由于细胞间的戮附是其生长、 分化和繁殖的基 础, 而C a , 十 、 Mg z + 对细胞间的翻附和结
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- 关 键 词:
- 构建 组织 工程 人工 食管 模型 实验 研究
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