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1、中国卫生检验杂志2 0 0 8 年8 月第1 8 卷第8 期 C h i n e s eJ o u r n a lo fH e a l t hL a b o r a t o r yT e c h n o l o g y ,A u g2 0 0 8 ;V o l1 8N o81 5 0 3 尼莫地平对皮质神经元缺糖缺氧性损伤的保护作用 王凤岩,谭剑斌,杨颖,李欣,陈瑞仪 ( 广东省疾病预防控制中心毒理所,广州5 1 0 3 0 0 ) 【论著】 摘要目的:探讨尼莫地平对缺糖缺氧培养的小鼠大脑皮质神经元的保护作用。方法:新生1 2d 小鼠的大脑皮质 神经元原代培养8d ,用含连二亚硫酸钠的无糖E
2、a r l e s 液模拟体内缺血性损伤,检测乳酸脱氢酶( L D H ) 的漏出量,细胞 生存率( M T F 法) 及细胞超氧化物歧化酶的活性,观察尼莫地平对神经元缺糖缺氧损伤的保护作用。结果:1 经缺糖缺 氧培养后,细胞培养液中的乳酸脱氢酶( L D H ) 漏出增多,细胞超氧化物酶( S O D ) 活性和细胞生存率显著降低( P 0 0 5 ) ; 2 尼莫地平组L D H 的漏出低于缺氧缺糖组,S O D 活性及细胞生存率明显提高( P 0 0 5 ) 。结论:尼莫地平对小鼠大脑 皮质神经元缺糖缺氧性损伤具有一定的保护作用。 关键词尼莫地平;神经元;原代培养;缺糖缺氧性损伤 中图分
3、类号】 R 9 6 5 1 文献标识码A 文章编号 t 0 0 4 8 6 8 5 ( 2 0 0 8 ) 0 8 1 5 0 3 0 2 P r o t e c t i v ee f f e c t so fn i m o d i p i n eo nc o r t i c a ln e u r o nc u l t u r e db yo x y g e ng l u c o s ed e p r i v a t i o n W a n gF e 昭一y a n ,T a nJ i a n b i n ,Y a n gY i n g ,L iX i n ,C h e nR u i y i
4、( G u a n g d o n gC e n t e rf o rD i s e a s eC o n t r o la n dP r e v e n t i o n ,G u a n g z h o u51 0 3 0 0 ,C h i n a ) A b s t r a c t O b j e c t i v e :T oi n v e s t i g a t et h ep r o t e c t i v ee f f e c t so fN i m o d i p i n eo nc u l t u r e dc o r t i c a ln e u r o no fm o u s
5、 et r e a t e db yo x y g e ng l u c o s ed e p r i v a t i o n M e t h o d s :P r i m a r yc o r t i c a ln e u r o n sf r o mn e o n a t em o u s e ( w i t h i n2 4 h ) w e r ec u l t u r e da n dt r e a t e dw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fN i m o d i p i n ec o n t a i n i
6、n gs e r u mo nt h e8 t hd a y ,N a 2 S 2 0 4e x h a u s t e so x y g e ni nm e d i aw h i l eg l u c o s ew a sr e m o v e d ,t h e nd e t e c t e dr e l e a s eo fl a c t a t ed e h y d r o g e n a s e ( L D H ) a n dv i a b i l i t yb yM T r a n dS O D a c t i v i t y R e s u l t s :1 T r e a t e
7、 dw i t ho x y g e ng l u c o s ed e p r i v o t i o n ,t h er e l e a s eo fL D Hi nt h ec e l ls u p e r n a t ei n c r e a s e da n dS O Da c t i v i t ya n dv i a b i l i t yo fn e u r o nd e c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y ( P 0 0 5 ) 2 T h er e l e a s eo fL D Hi nN i m o d i p i n eg
8、r o u pw a sl o w e rt h a nt h o s ei nt h eo x y g e ng l u c o s ed e p r i v a t i o ng r o u p , S O D a c t i v i t ya n dv i a b i l i t yo fn e u r o ni n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y ( P 0 0 5 ) C o n c l u s i o n :N i m o d i p i n ec a np r o t e c tn e u r o na g a i n s to x
9、y g e n g l u c o s ed e p r i v a i o ni n j u r y K e yw o r d s N i m o d i p i n e ;N e u r o n ;P r i m a r yc u l t u r e ;O x y g e ng l u c o s ed e p r i v a t i o n 缺糖缺氧培养引起的神经元损伤是模拟脑缺血缺氧性损 伤常用的体外模型。本研究利用培养的小鼠皮质神经元,以 连二亚硫酸钠清除培养基中的氧,并用缺糖培养基模拟神经 元在体内的缺血性损伤,观察尼莫地平对神经元缺糖缺氧损 伤的保护作用。 1 材料与方法 1 1
10、 主要仪器与试剂 N e u r o b a s a lM e d i a ,B 一2 7 ,D M E M 培养基,胰酶均购自G i b c o 公司;胎牛血清购白杭州四季青生物工程有限公司,M T I “ 购 自S i g m a 公司,尼莫地平购自德国拜尔公司。连二亚硫酸钠 ( N S :0 。) 及其他试剂为国产分析纯。2 4 2 4 2 型二氧化碳培 养箱( 美国S h e l d o n 公司) ;Z E I S SX D P 一1 2 倒置显微镜( 德国 Z E I S S 公司) ;V L S B S 超净工作台;V e r s a M a x 酶标仪( 美国M o 一 基金项
11、目广东省医学科研基金项目( B 2 0 0 5 0 0 4 ) 作者简介 王凤岩( 1 9 7 1 一) ,女,医学硕士,主管医师,主要从 事神经细胞缺氧损伤的研究。 l e c u l a r D e v i e e 公司) 。 1 2 实验方法 1 2 1 小鼠大脑皮质神经元的原代培养新生1 2d 内的 小鼠经7 5 乙醇浸泡1 2m i n ,取出大脑皮质,置于D H a n k s 液中剔除软脑膜与血管,剪碎后用0 1 2 5 胰酶置 3 7 。( 2 ,5 C O :培养箱中消化2 0m i n ,终止消化,2 0 0 目不锈钢 网过滤一次,1 0 0 0r m i n 离心1 0m
12、 i n ,弃去上清,调细胞数0 5 1 1 0 6 ,接种于经鼠尾胶原处理过的细胞培养板。2 4h 后 换培养基去除未贴壁细胞,以后每2 3d 换培养基一次。 1 2 2 小鼠大脑皮质神经元缺糖缺氧模型的建立及分组培 养至第8 天的神经元将其分成3 组:正常对照组,吸去原培养 液,用含1 0m m m o l L 葡萄糖E a r l e s 液洗2 次后孵育;模型组, 用无糖E a r l e s 液洗2 次,加入含0 5m m m o l L 连二亚硫酸钠 的无糖E a r l e s 液1m l 。尼莫地平组,在损伤处理前2 4h 加入 1 0 0I x m o l L 尼莫地平,其处
13、理方法与模型组相同。 1 2 3 上清液L D H 活力的测定培养细胞经缺影缺糖损伤 处理后,收集培养上清液,参照试剂盒说明测定培养液中的 L D H 活性。 万方数据 1 5 0 4 中国卫生检验杂志2 0 0 8 年8 月第1 8 卷第8 期C h i n e s eJ o u r n a lo fH e a l t hL a b o r a t o r yT e c h n o l o g y ,A u 9 2 0 0 8 ;V o l1 8 N o8 1 2 4 细胞存活率的检测经缺氧缺糖损伤处理后,去除原 培养液,用D H a n k S 洗一次,换无血清D M E M ,每孔加2
14、0 山 M ,r I ( 终浓度为0 5g L ) ,3 7 “ 2 继续培养4h ,弃上清液,每孔 加二甲基亚砜1 0 0 斗l ,震荡1 0m i n ,在酶标仪5 7 0 、6 3 0n m 测 O D 值,结果以二者差值表示。 1 2 5 细胞S O D 活性的检测培养细胞经缺糖缺氧损伤处 理后,弃去培养液,用P B S 洗2 遍,每孔加入0 1m o L LP B S 一 0 0 5m m o l LE D T A ( p H8 0 ) ,再加1 T r i t o n X 1 0 05 0 斗l ,将 培养板置振荡器震荡1m i n 使之溶解,加2 5 H ,P O 。1 0 0
15、山以 沉淀蛋白,3 0 0 0r m i n 离心1 5m i n ,取上清液按试剂盒说明测 定S O D 活性。 1 2 6 数据处理方法实验结果以i s ,采用S P S S t l 0 软件 包进行方差分析。 2 结果 2 1 尼莫地平对神经元缺糖缺氧性损伤的影响 正常皮质神经元折光性强,细胞突起清晰可见;经缺氧 缺糖损伤后,细胞折光性下降,突起收缩,部分胞体溶解。神 经元损伤后,L D H 释放人培养上清液,其活力可反映细胞受损 伤的程度。神经元经缺糖缺氧处理后,L D H 漏出明显增加、细 胞存活率下降,与空白对照组比较差异具有统计学意义( P 0 0 5 ) 。给予尼莫地平后能减轻
16、缺糖缺氧对神经元的损伤,与 缺糖缺氧组相比,L D H 的漏出明显减少,并使细胞存活率提高 ( P 0 0 5 ) 。如表1 所示。 表1 尼莫地平对神经元缺氧缺糖性损伤的影响( i s ,n = 6 ) # 表示与对照组比较P O 0 5 ;W - 表示与模型组比较P O 0 5 2 2 尼莫地平对缺氧缺糖损伤神经元S O D 活性的影响 神经元经缺糖缺氧损伤后,细胞S O D 活性明显降低,给予 尼莫地平后,细胞S O D 活性明显提高,与缺糖缺氧损伤组比 较,差异有统计学意义( P 0 0 5 ) 。结果见表2 。 表2 尼莫地平对缺糖缺氧神经元S O D 活性的影响( i - I -
17、$ ,矗= 6 l 组别S O D 活性( U m l 蛋白) 空白对照组 缺糖缺氧组 尼莫地平组 2 0 9 O 2 5 0 7 8 0 2 4 1 2 3 0 2 9 # 表示与对照组比较P 0 0 5 ; 表示与模型组比较P O 0 5 3 讨论 缺糖缺氧模型是体外模拟脑缺血缺氧常用的模型。缺氧 造成的神经元损伤与超氧化自由基的增加有关2 1 ,脑发生缺 血性缺氧损害时,A T P 供给不能满足细胞膜泵的功能需求,导 致细胞内离子稳态失衡( 钙离子超载) 、兴奋性氨基酸释放,激 活神经元蛋白酶和各种磷脂酶破坏细胞骨架与细胞膜;产生 超氧化自由基,脂质过氧化作用增强,神经细胞易受自由基攻
18、击而导致神经元发生退行性变直至细胞发生凋亡4 1 。由于 细胞膜的损伤,造成神经细胞乳酸脱氢酶( L D H ) 漏出增加,研 究表明神经细胞损伤的程度与L D H 的释放量成呈线性关 系”J 。本文的结果显示,神经元缺糖缺氧后L D H 漏出明显增 多,细胞生存率降低。 尼莫地平是二氢吡啶类钙通道阻滞剂,对神经元有直接 的保护作用,其作用机制与阻断细胞膜钙通道,减少细胞外钙 进入细胞内,同时可激活N a + 一K + 一A T P 酶,促进胞浆内钙的 排出,减少神经细胞钙超载所致的神经细胞坏死,保护脑组 织。同时使紊乱的钙离子交换趋于正常,减轻继发性脑损 伤MJ 。杨玉亭等。列在对大鼠急性脑
19、缺血再灌注损伤的研究 中,发现尼莫地平不但可降低细胞内钙离子浓度,还能提高细 胞S O D 活性。本研究利用神经元体外缺血模型,也提示尼莫 地平可减少L D H 的漏出,提高神经细胞S O D 活性,推测可能 与其稳定细胞内钙离子浓度有关,对细胞膜具有一定的保护 作用,从而减少了自由基对细胞膜的损伤。 参考文献】 1 P HC h a n R e a c t i v eo x y g e nr a d i c a l si ns i g n l i n ga n dd a m a g ei nt h ei s c h e m i cb r a i n J JC e r e b B l o o
20、dF l o wM e t a b ,2 0 0 1 ,2 1 ( 1 ) :1 1 4 2 CL ia n dR MJ a e k s o I LR e a c t i v es p e c i e sm e c h a n i s m so fc e l l u l a rh y p o x i a r e o x y g e n a t i o ni n j u r y J A mJP h y s i o l C e l lP h y s i o l ,2 0 0 2 ,2 8 2 ( 2 ) :C 2 2 7 2 4 1 3 TK r i s t i n ,B KS i e s j C
21、 a l c i u mi ni s c h e m i ec e l ld e a t h J S t r o k e ,1 9 9 8 , 2 9 ( 3 ) :7 0 5 7 1 8 4 MK i m u r a ,KS a w a d a ,TM i y a g a w a ,e ta 1 R o l eo fg l u t a m a t er e e e p t o r e a n dv o l t a g e d e p e n d e n tc a l c i u ma n ds o d i u mc h a n n e l si nt h ee x t r a e e l -
22、 l u l a rg l u t a m a t e a s p a r t a t ea c c u m u l a t i o na n ds u b s e q u e n tn e u r o n a li n j u r y i n d u c e db yo x y g e n g l u c o s ed e p r i v a t i o ni nc u l t u r eh i p p o c a m p a ln e u r o n s J JP h a r m a c o lE x pT h e r ,1 9 9 8 ,2 8 5 ( 1 ) :1 7 8 1 8 5
23、5 J YK o h ,D WC h o i Q u a n t i t a t i v ed e t e r m i n a t i o no fg l u t a m a t em e d i a t e d c o r t i c a ln e u r o n a li n j u r yi nc e l lc u l t u r eb yl a c t a t ed e h y d r o g e n a s ee f f i u x a s s a y J JN e u r o s c iM e t h o d s ,1 9 8 7 ,2 0 ( 1 ) :8 3 9 0 9 6 张春银,李作孝,谭华,等尼莫地平对脑出血后缺血性脑损害保 护作用的研究 J 中华老年心脑血管病杂志,2 0 0 6 ,8 ( 5 ) :3 2 2 3 2 4 7 杨玉亭,许爱琴,李光华尼莫地平对大鼠急性脑缺血再灌注损伤 的保护机制 J 齐齐哈尔医学院学报,2 0 0 6 ,2 7 ( 2 ) :1 3 9 1 4 0 ( 收稿日期:2 0 0 8 0 3 一1 8 ) 万方数据
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