模拟绞窄性肠梗阻发展过程的大鼠模型的建立.pdf
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1、第2 7 卷第3 期实验动物科学 V 0 1 2 7N o 3 2 0 1 0 年6 月 L A B O R A T O R YA N I M A LS C I E N C EJ u n e2 0 1 0 驴驴彩、廖谚,驴坤 研究论著 易q 、盔 驴q 多、。j & - 圆 模拟绞窄性肠梗阻发展过程的大鼠模型的建立 白洋傅 卫 袁国红陶明张同琳 ( 北京大学第三医院普通外科,北京1 0 0 0 8 3 ) 摘要:目的建立一种可以模拟绞窄性肠梗阻发展过程的大鼠模型,要求肠管的损伤程度呈现出较明显的时间相 关性和同步性。方法选取成年健康雄性S p r a g u e D a w l e y 大鼠,
2、制作腹壁嵌顿疝模型。模型中腹壁缺损的长度( 疝 环的半周长) 为待嵌顿肠管管径的8 0 ,将长度为6c m 的选定肠管自腹壁缺损处脱出埋置于皮下,形成腹壁嵌顿 疝,模拟绞窄性肠梗阻。根据肠管嵌顿时间的增加,依次将模型分为六组,嵌顿时间自lh 起,每组依次增加lh ,最 长为6h ,设置假手术对照组。通过光镜下病理检查,确定肠管损伤程度并根据肠管坏死的程度进行分级,应用 R i t i d 分析比较各组之间肠管损伤程度的差异。结果与对照组比较,各实验组均呈现不同程度的肠管损伤。经过 R i t i d 分析,对照组肠管损伤分级的平均R i t i d 值为0 0 3 8 ,各实验组依嵌顿时间递增
3、排序,自嵌顿1h 组至嵌顿6h 组,各组肠管损伤分级的平均R i t i d 值依次为0 2 4 8 、0 3 2 9 、0 4 6 4 、0 5 5 1 、0 7 6 5 和0 8 7 4 。通过方差分析中的L S D 两两检验,可以看到各实验组与对照组相比,肠管损伤程度均存在明显差异,P 值均小于0 0 3 5 ;各实验组间,嵌顿 时间相差2h 及以上者,肠管损伤程度均存在明显差异,P 值均小于0 0 1 ;嵌顿4h 与5h 组间,肠管损伤程度存在 明显差异,P = 0 0 1 ,余嵌顿时间相差1h 的各实验组间,肠管损伤程度无明显差异,P 值均大于0 0 9 。结论本实 验制备的大鼠腹壁
4、嵌顿疝模型较好地模拟了绞窄性肠梗阻的发展过程,随着嵌顿时间的延长,肠管损伤程度渐进 性加重;相近的嵌顿时间,肠管的损伤程度无明显差别;肠管的损伤程度呈现出较明显的时间相关性及同步性。 关键词:肠梗阻;肠绞窄;动物模型 中图分类号:R 一3 3 2文献标识码:A文章编号:1 0 0 6 6 1 7 9 ( 2 0 1 0 ) 0 3 - 0 0 1 4 - 0 5 肠梗阻是外科临床常见病,目前其主要病因为 粘连性肠梗阻q ,大多数患者可以通过非手术治 疗康复H 。,但如果进展为绞窄性肠梗阻需要行肠切 除,手术死亡率可高达3 0 “ 1 ,因此预测肠管是否 发生绞窄、评价绞窄性肠梗阻中肠管的损伤程
5、度尤 为重要。建立绞窄性肠梗阻动物模型将为进一步研 究其病生理变化奠定基础。本实验意在前人实验研 究的基础上改进并制备一个可靠的绞窄性肠梗阻大 鼠模型,能较好的模仿绞窄性肠梗阻进展过程,显现 出肠管损伤程度与绞窄时间的相关性及相同绞窄时 间肠管损伤的一致性。 1 材料和方法 1 1 动物和实验分组 成年健康雄性S p r a g u e D a w l e y 大鼠3 9 只,体重 2 0 0g 士1 0g ,饲养于标准实验室环境,予以1 2h 光 照1 2h 黑暗的昼夜光周期性变化,饲养室温度控制 在2 3o C 1 ,相对湿度控制在5 0 - I - 1 0 。所用 饲料及饮用水均由北京大
6、学医学部实验动物科学部 提供,实验大鼠为清洁级,许可证号:S C X K ( 京) 2 0 0 6 - 0 0 0 8 。大鼠随机分为7 组,对照组3 只,为假 手术组;实验组3 6 只,为手术组。根据肠管嵌顿时 间不同分为六组,每组6 只,第一组为嵌顿1h 组,其 余各组嵌顿时间递增1h ;最长嵌顿时间为6h 。 1 2 模型制作方法 手术前大鼠禁食1 2h ,可饮水;2 戊巴比妥钠 ( 5 0m s k g ) 腹膜腔注射麻醉,取仰卧位,8 硫化钠 腹部脱毛,0 5 络合碘消毒皮肤。 对照组手术:下腹部正中切口长约3c m ,逐层 切开皮肤及腹壁肌肉,游离皮肤与腹壁肌肉间的间 隙,开腹后暴
7、露肠管约3m i n ,腹膜腔内注射生理盐 水2m L ,3 - 0 丝线分别连续缝合肌肉和皮肤。 实验组手术:下腹部正中切口长约3c m ,逐层 收稿日期:2 0 1 0 0 3 2 8 作者简介:白洋( 1 9 7 7 一) ,男,主治医师。研究方向:胃肠外科和肝脏外科。 万方数据 第3 期白洋等:模拟绞窄性肠梗阻发展过程的大鼠模型的建立 1 5 切开皮肤及腹壁肌肉,游离皮肤与腹壁肌肉间的间 隙,将距回盲瓣约2c m 的末端回肠提出作为待嵌顿 肠管;选取并标记嵌顿部位,测量嵌顿部位肠管宽度 X ;设定疝环长度为Y = 0 8X X ;腹壁肌层切口一端 以丝线缝合,该缝合点设为A ,在腹壁切
8、口上取B 点 全层缝合肌肉,使残留切口A B 的长度为y ,形成长 度为y 的疝环;将选定的末端回肠自疝环脱出,脱 出肠管约6c m ;3 - 0 丝线连续缝合腹部肌肉,腹膜腔 内注射生理盐水2m L ;充分游离皮下间隙,将脱出 的肠管置于皮下腔隙内,确保皮肤缝合后对脱出肠 管无压迫,3 - 0 丝线连续缝合皮肤( 图1 ) 。 腹 图1 绞窄性肠梗阻模型示惹图 1 3 病理学检查 对照组分别于术后1h 、3h 和5h 处死大鼠并 获取肠管标本;实验组于预定时间分组处死大鼠并 获取肠管标本。 标本的获取1 2 戊巴比妥钠( 5 0m g k g ) 腹膜 腔注射麻醉,取仰卧位,去除皮肤缝线;对
9、照组去除 腹肌缝线,切取部分肠管;实验组于疝环处结扎肠 管,切取部分肠管;4 多聚甲醛浸泡保存病理标本; 心脏注射空气处死大鼠。 病理学评估:肠管标本行病理学检查,常规H E 染色。由同一位病理学医师对全部标本进行评估,该 病理学医师不了解肠管嵌顿时间。参照M u s e m e c h e 等。6 1 的研究,光镜下以肠管坏死的层次作为评价指标 将肠管损伤状态分为五级,依次评分为0 - 4 分( 见表 1 ) ,比较各组之间肠管损伤程度的差异。 表1肠管损伤病理诊断标准 分值 0 l 2 3 4 肠管损伤诊断标准 无组织坏死 粘膜层部分坏死 粘膜层全部坏死 肌肉层部分坏死 肌肉层全部坏死 1
10、 4 统计学分析 比较实验组与对照组间肠管损伤病理学评分的 均值,统计方法采用R i d i t 分析及L S D 方差分析,统 计学软件采用S P S Sf o rw i n d o w s11 5 。 2 结果 对照组肠管病理学检查基本正常。与对照组相 比,各实验组均呈现出不同程度的肠管损伤。光镜 下可以见到不同程度的粘膜层充血、细胞脱落、坏 死,肌层细胞细胞核溶解、纤维断裂、坏死( 见图2 ) 。 以肠管坏死的层次作为评价指标将肠管损伤状态分 图2 肠管损伤病理结果 A :肠绞窄发生1 2h ,粘膜层充血,肌层细胞基本完整; B :肠绞窄发生3 4h ,粘膜层充血,肌层部分细胞坏死; C
11、 :肠绞窄发生5 6h ,粘膜层充血,肌层细胞大部坏死 万方数据 1 6 实验动物科学2 7 卷 为五级,依次评分为0 4 分,得到各组肠管损伤评 分分级结果( 见表2 ) 。经过R i t i d 分析,对照组肠管 损伤分级的平均R i t i d 值为0 0 3 8 ,各实验组依嵌顿 时间递增排序,自嵌顿1h 组至嵌顿6h 组,各组肠 管损伤分级的平均R i t i d 值依次为0 2 4 8 、0 3 2 9 、 0 4 6 4 、0 5 5 l 、0 7 6 5 和0 8 7 4 。通过方差分析中的 L S D 两两检验,可以看到各实验组与对照组相比,肠 管损伤程度均存在明显差异,P
12、值均小于0 0 3 5 ;各 实验组间,嵌顿时间相差2h 及以上者,肠管损伤程 度均存在明显差异,P 值均小于0 0 1 ;嵌顿4h 与5 h 组间,肠管损伤程度存在明显差异,P = 0 0 1 ,余嵌 顿时间相差1h 的各实验组间,肠管损伤程度无明 显差异,P 值均大于0 0 9 。 表2 各组大鼠肠管损伤分级 分级评分 研究分组 2 h3 h4h5 h6 h 对照组 1h 合计 3 讨论 统计资料提示,在全部急诊患者中有3 因肠 梗阻入院H 。,目前肠梗阻病人的死亡率约为3 左 右H 1 ,但是当肠梗阻进展为绞窄性肠梗阻时需行肠 切除,手术死亡率升高,最高可达3 0 “ 、8 1 。因此,
13、 如何预测绞窄性肠梗阻的发生,在肠管出现不可逆 坏死的病理改变之前,准确判定肠管损伤的情况,及 时手术缓解肠梗阻,避免肠切除,降低患者死亡率, 成为外科医生十分关注的问题。我们需要建立一个 能够模拟绞窄性肠梗阻发展过程的实验动物模型。 通过对该模型的研究,希望找到一个时间点,在该时 间点之前解除绞窄性肠梗阻,肠管不会发生不可逆 损伤,不需要实施肠切除手术,而在该时间点之后, 即使解除了绞窄性肠梗阻,肠管仍会出现不可逆的 肠坏死,必须实施肠切除手术治疗。 以往研究已经建立的与此相关的动物模型主要 分为两类,一类为肠缺血动物模型,一类为肠梗阻动 物模型。就肠缺血动物模型而言,大多通过结扎肠 系膜血
14、管或通过限制肠系膜血管血流量的方式模拟 肠缺血状态“ “,而绞窄性肠梗阻是由于肠梗阻导 致肠管内压力增高,进而影响肠管血循环,由肠管淤 血进而导致肠管缺血的病生理过程。绞窄性肠梗阻 并非单纯的肠管缺血改变,其病生理改变亦与肠管 缺血不尽相同。所以,肠缺血动物模型并不能模拟 绞窄性肠梗阻。 本世纪初,A h m e t 等。1 4 1 在研究中介绍了大鼠绞 窄性肠梗阻模型的建立方法,该模型的核心技术为 在大鼠腹壁制造一个长度为0 5c m 的缺损,通过该 腹壁缺损脱出部分小肠肠管埋置于皮下,再以荷包 缝合缩紧腹壁缺损,形成腹壁嵌顿疝,模拟绞窄性肠 梗阻,该模型的优点在于比较贴近临床实际情况。 有
15、研究表明,目前临床工作中遇到的肠梗阻主要为 粘连性肠梗阻。,导致其进展为绞窄性肠梗阻的 主要原因为内疝或腹壁疝1 “,因此,通过制作腹壁 嵌顿疝模型来模拟绞窄性肠梗阻是比较接近于临床 实际的。该模型的另一个优点在于,当嵌顿时间足 够长时,肠管均能达到完全坏死,也就是可以完整的 模拟绞窄性肠梗阻的发展过程。 但是,如果在既往建立的大鼠绞窄性肠梗阻模 型上,进行关于绞窄性肠梗阻发生进程的研究,就会 发现原有模型存在严重的缺陷。首先,以往的大鼠 绞窄性肠梗阻模型都是以病理学诊断来评估肠管损 伤的程度,因此在获取研究数据的同时,必须处死大 鼠获取肠管标本。如果研究的目标是寻找一个评判 肠管损伤是否可逆
16、的时间点,就需要在大鼠模型上 复制一个完整的“肠梗阻肠绞窄一肠损伤一绞窄 。,。一一一一 。:。一一一一 。,。一 。:。一一一一一 。4:。一一一一 3 O O 0 O 3 O 一 ,“ 一,显显 一一一一一一一一一一一 万方数据 第3 期自洋等:模拟绞窄性肠梗阻发展过程的大鼠模型的建立 1 7 解除一肠损伤恢复”的过程,因此,不能在获取研究 数据的同时处死大鼠获取肠管标本,无法评判肠管 的损伤程度;其次,在实际科研工作中,因为大鼠的 血容量有限,对其进行连续取血研究是不现实的。 为了解决这两个问题,我们需要对绞窄性肠梗阻模 型中的大鼠进行分组,如果能保证同组模型内的大 鼠肠管损伤进程一致或
17、接近,那么我们就能以分组 中任意一只大鼠的肠管病理结果来评估全组大鼠的 肠管损伤程度;同时,我们可以将在同一只大鼠的不 同肠管绞窄时程取血,改为对不同肠管绞窄时程的 大鼠取血,从而解决取血问题。 我们需要一个肠管损伤程度可控的绞窄性肠梗 阻大鼠模型,也即在相同的的绞窄时间内,模型中不 同的大鼠肠管坏死的程度应相同或相近,这正是以 往的绞窄性肠梗阻模型所不能提供的。原模型缺点 产生的原因:模型中腹壁疝环的直径是固定的, 其半环长度为5m m ,但是被嵌顿的肠管的管径是不 同的,这就造成了肠管压迫强度的不同;模型中将 肠管脱出后,荷包缝合疝环以达到压迫肠管的目的, 而荷包缝合后疝环的口径就是未知的
18、了。由于以上 两个原因,所以在原模型中,嵌顿肠管的受压迫程度 是不可控的,自然发生绞窄性肠梗阻的肠管的损伤 程度也就很有可能不同。 基于上述原模型存在的优缺点,我们对其进行 了改进,将疝环的直径( 半环长度) 由固定的5m m 变为根据嵌顿肠管的管径设置,并省略了原来对疝 环的荷包缝合,希望对不同管径的肠管产生尽量接 近的压迫程度。在预实验中,我们首先采取了结扎 一段小肠的方法,在这种严重绞窄的极端情况下,肠 管大多在发生绞窄2h 左右完全坏死,病程进展过 快,不易观察变化,且因肠管和系膜完全结扎,肠管 回流的血液很可能无法进入体循环,从而影响实验 结果,因此我们放弃了这种极端条件下的模型设计
19、。 而后,我们分别进行了疝环长度为0 6 倍、0 8 倍和 1 0 倍肠管管径的模型实验,结果发现当疝环长度 为0 8 倍肠管管径时,肠管大多在6h 左右出现完 全性坏死,病程发展速度较理想,因此我们最终选定 了0 8 倍肠管管径作为疝环长度。在绞窄肠管长度 的选择上我们也进行了预实验,分别选用了6c m 和 8c m 的肠管作为绞窄肠管。我们在预实验中发现, 随着绞窄时间的延长,绞窄肠管内的体液增多,而全 身的血容量下降,如果选用8c m 的肠管作为绞窄肠 管,则当实验进行到肠管完全坏死,处死大鼠取血 时,大鼠体循环剩余血量不足4m L ,不足以完成实 验数据采集;而绞窄肠管长度为6c m
20、时,剩余血量 大概为6 8m L ,基本可以满足实验数据的采集;如 果继续缩短绞窄肠管的长度,我们担心会因绞窄肠 管量的不足影响实验结果,我们最终选定绞窄肠管 长度为6c m 。为了进一步保证实验结束时大鼠的 体循环血量,我们在模型制备完成时在大鼠腹腔内 注射2m L 生理盐水,以补偿手术过程中的体液损 失。 从本实验制备的大鼠腹壁嵌顿疝模型,可以观 察到随着嵌顿时间的延长,肠管损伤程度渐进性加 重;相近的绞窄时间,肠管的损伤程度无明显差别。 此模型较好的模拟了绞窄性肠梗阻的发展过程,肠 管的损伤程度呈现出较明显的时间相关性及同步 性,可用于绞窄性肠梗阻的病生理研究。 参考文献 W a n g
21、 e n s t e e n0H 。P a i n eJR T r e a t m e n to fi n t e s t i n a lo b s t r u c t i o n b ys u c t i o nw i t hnd u o d e n a lt u b e J J A M A ,1 9 3 3 ,1 0 1 :1 5 3 2 W a n g e n s t e e nOH H i s t o r i c Ma s p e c t so ft h em a n a g e m e n to fa c u t e i n t e s t i n a lo b s t r u c
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