热休克预处理在大鼠脊髓损伤后细胞凋亡中的作用.pdf
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1、J o u m a l o f Me d ic a l F o r u m V o l . 2 6 N o . 1 3 J u l y 2 0 0 5 4 3 热休克预处理在大鼠脊髓损伤后 细胞凋亡中的作用 王 勇张永福毛伯锗 河南省人民医院神经外科郑州市4 5 0 0 0 3 摘要目的 探讨大 鼠脊髓损伤 后热休克蛋白7 0 ( H S P 7 0 ) 和氧化氮合酶( i N O S ) 在细胞凋亡中的作用 方法将 9 6只大鼠分为对照组、 损伤组和热休克预处理组。采用静压型脊敌损伤模型, 分别在伤后6 h , 1 2 h , I 天, 2天, 3天, 1 周, 2 周和3周处死动物用原位杂
2、交技术检测 H S P 7 0 m R N A在以上各时点的表达。同时用免 疫组化法检测 H S P 7 0 , i N O S在各时点的表达。运用 T O N E L法检测凋亡细胞。另外, 用C B S评分来评枯神经功 能。结果C B S 评分显示, 热休克预处理组的神经功能明显好于损伤组(P0 . 0 5 ) 凋亡细胞数在损伤组显 著高于热休克预处理组( 尸 0 . 0 5 ) ,通过原位杂交 和免疫组化发现, H S P 7 0 m R N A和蛋白水平在热休克预处 理组明显高于损伤组( P 0 . 0 5 卜 免疫组化的结果还显示, iN O S的量在热休克预处理组明显低于损伤组( P
3、 。 . 仍) 。结论热休克预处理能减轻脊髓损伤后的细胞调亡, 其机理可能同H S P 7 0合成增加, 并进一步抑制 i N O S的表达有关 关键词眷髓损伤 热休克预处 理热 休克蛋白7 0 i N O S 凋亡 图分类号: R一 3 3 2文献标识码: A文章编号: 1 6 7 2 - 3 4 2 2 ( 2 0 0 5 ) 1 3 - 0 0 4 3一 0 3 E ff e c t s o f H y p e r t h e r m i c P r e c o n d i t io n i n g o n A p o p t o s i s a f t e r S p i n a l
4、C o r d I n j u r y i n R a t s W A N G Y o n g , Z H A N G Y o n 动i , M A 0 B o y o n g D e p a r t m e n t o f N e u r o s u r g e r y , H e n a n P r o v i n c i a l P e o p le s H 峋) it a l , Z h e n g z h o u 4 5 0 0 0 3 , C h i n o A B S T R A C T O b j e c t i v e T o s t u d y th e e ff e c
5、t s o # H S P 7 0 a n d i N O S o n a p o p t o s i s a f t e r s p i n a l c o r d i n j u ry i n r a t s . M e t h o d s A t o ta l o f 9 6 r a t s w e r e d i v id e d i n t o c o n t r o l ( A ) , t r a u m a ( B ) a n d h y p e r - t h e r m i c p re c o n d i t i o n in g ( C ) g r o u p . S p
6、 i n a l c o r d i n j u ry ( S C I ) m o d e l s w e re m a d e 场 s t a t i c c o m p r e s s io n . T h e a n i m a l s w e r e d e c a p i t a t e d a t 6 h , 1 2 h , l d , 2 d , 3 d , l w , 2 w a n d 3 w a f te r i n j u ry . H S P 7 0 a n d i N O S e x - p r e s s i o n i n s p i n a l c o r d
7、w e re d e t e c t e d b y u s i n g i m m u m o h i s ta c h e m i c a l t e c h n i q u e.H S P 7 0 m R N A e x - p r e s s i o n i n s p i n a l c o r d w e r e d e t e c t e d b y u s i n g i n s i t u h y b r i d i z a t io n ( I S H ) m e t h o d . C e l l s a p o p to s i s w e r e e x a m i
8、n e d 场t h e T U N E L r e a c t i o n . N e u r o lo g i c a l o u t c o m e w e r e e v a l u a t e d b y t h e c o m b i n e d b e h a v i o r a s c o r e ( C B S ) . R e s u l ts N e u r o l o g i c a l o u t c o m e i n t h e g ro u p C w a s s ig n i fi c a n t ly h i g h e r t h a n i n th e
9、g r o u p B ( P0 . 0 5 ) . I S H a n d i m m u n o h i s t o c h e m i s t ry a n a l y s i s s h o w e d t h e l e v e l o f H S P 7 0 m R N A in t h e g ro u p C w a s s i g n i fi c a n tl y h i g h e r t h a n i n t h e g r o u p B ( P0 . 0 5 ) . T h e l e v e l o f i N O S i n t h e g ro u p C
10、w e re s i g n i f i c a n tl y l o w e r t h a n i n t h e g r o u p B ( P0 . 0 5 ) . I n t h e g r o u p C, t h e n u m b e r o f a p o p t o t i c c e l l s w e r e s i g n i f i c a n tl y l e s s t h a n t h o s e i n g r o u p B ( P0 . 0 5 ) . C o n c l u s i o n H y p e r th e r m i c p r e c
11、 o n d i - t i o n in g m i g h t d e c r e a s e a p o p t o s i s , w h i c h m i g h t b e a s s o c ia t e d w i t h t h e i n d u c t i o n o f H S P 7 0 s y n t h e s is , s u g g e s t i n g t h a t H S P 7 0 p r e v e n t s a p o p t o s is b y i n t e r a c t i n g w i t h i N O S . KE Y WO
12、R D S S C I ; h y p e r t h e r m i c p r e c o n d i t i o n i n g ; H S P 7 0 ; i N O S ; A p o p t o s i s 细胞凋亡在脊髓损伤的继发性损害中起着关 键 作 用 1 1 。 我 们 通 过热 休 克 预处 理 诱 导大鼠 产生 热 休克蛋白7 0 ( h e a t s h o c k p r o t e i n 7 0 H S P 7 0 ) , 应用 D N A缺口 末端标记( T U N E L ) 技术观察其对细胞凋 亡的影响, 通过原位杂交技术检测 H S P 7 0 m R
13、 N A 及免疫组化 L S A B法检测 H S P 7 0和氧化氮合酶 医 药论坛杂志 2 0 0 5 年7 月 第2 6 卷 第1 3 期 ( i N O S ) 的表达, 来探讨 H S P 7 0和 i N O S影响细胞 凋亡的机理。 1 材料与方法 1 . 1 动物模型( S D ) 大鼠麻醉后, 打开椎板将 3 0 ; 重物通过( 2 x 5 ) m m光滑金属垫片压迫于脊 髓后正中, 时间为 l o m i n , 以此来制做压迫模型。 1 . 2 动物分组取( 2 5 0 士 5 0 ) g 的雄性 S D大鼠 9 6只, 随机分为 3组。A组( 对照组) 1 6只, 不作
14、 预处理, 置室温( 1 8 一2 2 9 0) 中仅行椎板切开; B组 ( 损伤组) 4 0只: 不作预处理, 置室温( 1 8 一 2 2 9C ) 中行椎板切开并进行压迫处理制作脊髓压迫伤模 型; C 组( 热休克预处理组) 4 0 只, 大鼠麻醉后, 置 4 5 水浴箱中, 使其肛温升至4 2 后, 转至4 2 水 浴箱中维持 1 5 m i n , 然后置室温恢复 6 h后制作脊 髓压迫伤模型。各组在伤后 6 h , 1 2 h , 1 天 、 2天、 3 天、 1 周、 2 周和3周共 8个时点进行观察 , 其中 A 组每个时点2只, B和 C组每个时点各5只。 1 . 3 试剂与
15、方法 H S P 7 。 原位杂交检测 试剂盒及 H S P 7 0 和i N O S 兔抗大鼠多克隆抗体购白 武汉博 士德公司。 原位杂交按试剂盒说明进行, 免疫组 织化学应用 1 S A R法( 工作浓度均为 11 0 0 ) o 1 . 4 结果评定标准在光镜下, 原位杂交以细胞 胞浆出现棕黄色颗粒为阳性, 免疫组化 H S P 7 0以 胞浆或胞核中出现棕黄色颗粒为阳性; i N O S以 胞 浆中出现棕黄色颗粒为阳性。每张切片在相同放 大倍数下, 各选取阳 性细胞最集中的1 0 个视野, 每 个视野数 1 0 0个细胞, 计算出每张切片上阳性细胞 的百分率。 1 . 5 统计分析 数
16、据以无士 、 表示, 以 检验进行 显著性检验 。 其表达。余下的观察点未见表达, 结果见表 t o 2 结果 2 . 1 H S P 7 0 m R N A原位杂交结果对照组未 见 H S P 7 0 m R N A 表达。 损伤组在伤后6 h 可见 表达, 1 2 h 明显减少, 在以后的观察点基本为阴性。阳性 细胞主要是神经元, 同 时有部分胶质细胞呈阳 性。 热休克预处理组的H S P 7 0 m R N A的表达量在6 h , l 2 h 均大于损伤组( P 0 . 0 5 ) ; 而且在2 4 h还可见 表1 H S P7 0 . R N A的 原位杂交结果( x 士 s ) 分
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- 休克 预处理 大鼠 脊髓 损伤 细胞 中的 作用
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