微透析技术实时检测肾热缺血后葡萄糖变化的动物实验研究.pdf
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1、生垦丝剑壁塾盘查! 壁塑生! 旦箜! 鲞箜! 塑垦! 垫! 坚堕鱼! ! 竖s ! 婪! 堡! ! Q 塑:! ! ! :! :塑! :! 微透析技术实时检测肾热缺血后葡萄糖 变化的动物实验研究 张树栋闫龙涛林雨青卢剑侯小飞马潞林毛兰群 ( 北京大学第三医院泌尿外科,北京1 0 0 1 9 1 ) 2 2 5 实验研究 【摘要】 目的探讨应用微透析技术研究兔肾热缺血再灌注损伤后肾皮质葡萄糖浓度变化规律的可行性。 方法新 西兰大耳白兔2 0 只,其中实验组l O 只,麻醉后游离出右肾及其动静脉,将微透析探针置入肾背侧皮质内,复方氯化钠溶液持 续灌注平衡6 0m i n 后,连接电化学分析系统,阻
2、断肾动静脉6 0r a i n ,然后开放动静脉,观察6 0m i n 。利用电化学方法实时在线 检测肾透析液中葡萄糖含量的变化。对照组l o 只,仅游离出肾动静脉而不结扎,同样留置微透析针取样,连续检测葡萄糖浓 度,比较2 组在正常灌注期、缺血期和再灌注期葡萄糖浓度的变化。结果葡萄糖电极的电流响应与其浓度呈良好的线性 关系。微透析针的网收率在( 6 3 6 2 1 ) 。实验组兔肾皮质难常状态下测得的透析液葡萄糖浓度为( 1 8 9 0 3 7 ) m m o l L , 缺血期葡萄糖浓度为( 0 6 9 0 1 2 ) m m o L ( L S D 检验,P = 0 0 0 0 ) 。缺
3、血期较自身正常灌注期降低( 3 6 7 2 4 ) ;再灌注期葡 萄糖浓度为( 0 6 2 0 1 4 ) m m o l L ( L S D 检验,P = 0 0 0 0 ) 。与对照组比较,实验组缺血期( t = 一1 1 9 7 5 ,P = 0 0 0 0 ) 和再灌注期 ( t = 一1 1 9 9 3 ,P = 0 0 0 0 ) 葡萄糖浓度显著降低。结论应用微透析与活体在线电化学技术相结合的方法可以方便、灵敏检 测肾缺虹再灌注损伤后葡萄糖水平,可以较好地实时反映肾皮质缺血状态。 【关键词】微透析;电化学检测;肾;缺血再灌注;葡萄糖 中图分类号:R 一3 3 2文献标识:A文章编号
4、:1 0 0 9 6 6 0 4 ( 2 0 0 9 ) 0 3 0 2 2 5 一0 5 G l u c o s eM e t a b o l i s mi nt h eW a r mI s c h e m i a R e p e r f u s l o nI n j u r e dK i d n e yo fR a b b i t s :I nV i v oM i c r o d i a l y a l sa n dR e a l - T i m e E l e c t r o c h e m i c a lD e t e c t i o nZ h a n gS h u d o n g ,
5、Y a nL o n g t a o ,L i nY u q i n g ,e ta 1 D e p a r t m e n to fU r o l o g y ,P e k i n gU n i v e r s i t yT h i r d H o s p i t a l ,B e i j i n g1 0 0 1 9 1 ,C h i n a 【A b s t r a c t 】O b j e c t i v e T oi n v e s t i g a t et h ec h a n g eo fg l u c o s em e t a b o l i s mi nw a r mi s
6、c h e m i a r e p e r f u s i o ni n j u r e dk i d n e yo f r a b b i t si nv i v ob ym i c r o d i a l y s i sa n dr e a l t i m ee l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o n M e t h o d sAt o t a l o f2 0N e wZ e a l a n dr a b b i t sw e r ed i v i d e d i n t oe x p e r i m e n ta n dc o n t
7、r o lg r o u p s ( 1 0i ne a c h ) A f t e ra n e s t h e s i ab yi n t r a v e n o u si n j e c t i o no fb a r b i t o n e ,a no b l i q u ei n c i s i o nu n d e rt h e 1 2 t hr i dW a gm a d ei nt h ea n i m a l st oe x p o s et h er i g h tk i d n e ya n dt h er i s h tr e n a la r t e r ya n d
8、v e i n A f t e r w a r d s ,am i e r o d i a l y s i sp r o b eW a g p l a c e di n t ot h ed o r s a lr e n a lc o d e xa l o n gt h el o n ga x l eo ft h ek i d n e y A f t e r6 0m i n u t e st oe q u i l i b r a t e ,a ne l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o n s y s t e mw a su s e dt oc o
9、 n t i n u o u s l yd e t e r m i n et h ec o n c e n t r a t i o no fg l u c o s ei nt h er e n a lc o r t e xb e f o r ei s c h e m i a T h e n ,i s c h e m i a r e p e r f u s i o n i n j u r ym o d e lw a se s t a b l i s h e db yc l a m p i n gt h er e n a lp e d i c l ef o r6 0m i n u t e sf o
10、 l l o w e db yp e r f u s i o nf o r6 0m i n u t e s T h ec o n t r o lg r o u p r e c e i v e dt h es a m ei n t e r v e n t i o nw i t h o u tc l a m p i n gt h er e n a lp e d i c l e T h eg l u c o s ec o n c e n t r a t i o no ft h em i c r o d i a l y s i ss a m p l e sw e r ea n a l y z e d
11、b e f o r e 。d u r i n g ,a n da f t e rt h ei s c h e m i a R e s u l t sT h er e a c t i o no ft h eg l u c o s ee l e c t r o d et ot h ee l e c t r i cc u r r e n tw 鼬l i n e a r l yc o r r e l a t e d w i t ht h ec o n c e n t r a t i o n so fg l u c o s e ,a n dt h er a t eo fm i c r o d i a l
12、 y s i sp r o b er e c y c l i n gw a s ( 6 3 6 2 1 ) T h ec o n c e n t r a t i o no fs l u c o s ei n t h er e n a lc o r t i c a li n t e r s t i t i a ls a m p l e sw e r e ( 1 8 9 0 3 7 ) ,( 0 6 9 0 1 2 ) ,a n d ( 0 6 2 0 1 4 ) m m o l Lr e s p e c t i v e l yb e f o r e 。d u r i n g , a n da f
13、 t e rt h ew a r mi s c h e m i a D u r i n gt h ei s c h e m i ap h a s e 。t h em e a nc o n c e n t r a t i o no fg l u c o s ed e c r e a s e db y ( 3 6 7 2 4 ) f r o mt h e b a s el e v e l ( L S Dt e s t ,P = 0 0 0 0 ) T h eg l u c o s ec o n c e n t r a t i o no ft h ee x p e r i m e n t a lg
14、r o u pw a ss i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h a ti nt h ec o n t r o l a tb o t hi s c h e m i aa n dr e p e r f u s i o np h a s e s ( t = 一1 1 9 7 5 ,P = 0 0 0 0 ;t = 一1 1 9 9 3 ,P :0 0 0 0 ,r e s p e c t i v e l y ) C o n c l u s i o n s nv i v o m i c r o d i a l y s i sc o m b i n e
15、dw i t he l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o np r o v i d e sU s e n s i t i v ea n dr e a l t i m em e t h o df o rm e a s u r i n gt h eg l u c o s ec o n c e n t r a t i o n i nW a r l ni s c h e m i a r e p e r f u s i o ni n j u r e dk i d n e y ,w h i c hc a ns u g g e s tt h ei s e h
16、e m i ec o n d i t i o no ft h er e n a lc o r t e x 通讯作者 ( 中国科学院化学研究所,北京1 0 0 1 9 0 ) 万方数据 2 2 6 主垦丝剑壁塑塑查! ! ! ! 堡! 旦塑! 鲞箜! 塑垦! 也! 堕堕! 型! ! 堡! 坚! 竺! ! ! Q ! :! ! ! :! :塑! :! 【K e yW o r d s 】M i e r o d i a l y s i s ; E l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o n ; K i d n e y ;l s c h e m i a r
17、e p e r f u s i o n ; G l u c o s e 在腹腔镜肾部分切除、开放肾部分切除、肾移植 等泌尿外科手术过程中,经常需要临时阻断肾血管, 肾脏缺血和再灌注过程会对肾脏带来不同程度的损 害,直接影响肾脏的早期功能恢复和远期存活。肾 脏缺血再灌注损伤的机理十分复杂,涉及能量代谢 障碍、氧自由基生成增多、C a 2 + 超载等多种复杂因 素,也是目前研究的热点问题1 1 。在人体组织、器 官能量代谢方面主要监测的指标有葡萄糖、丙酮酸 和乳酸,葡萄糖是反映肾脏缺血与有氧代谢的一种 重要指标瞄- 。由于肾脏皮质的能量代谢主要以有 氧代谢为主,对缺血极为敏感。生理状态下,葡萄糖
18、的糖分解作为唯一的代谢过程能够提供大量的三磷 酸腺苷( A T P ) ,细胞在辅酶参与下将葡萄糖代谢为 丙酮酸而产生A T P 。当肾动脉阻塞时,氧供应不足, 葡萄糖有氧氧化不能正常进行,继而转为以乳酸发 酵为主的无氧代谢,乳酸水平增高。此时肾脏A T P 能源迅速衰减,缺氧使线粒体不能进行正常的氧化 磷酸化,细胞膜的主动转运机制失活,从而导致细胞 膜受损,细胞水肿乃至坏死,严重影响肾脏生理功 能1 。由于葡萄糖是能量代谢中最基础的物质,因 此为充分了解肾缺血过程中能量代谢的化学机制, 探讨适用于跟踪检测肾缺血过程中能量代谢物葡萄 糖的分析方法平台具有重要的意义。 目前多数对于葡萄糖的检测技
19、术需离体后收集 样品测量,不能实时监测葡萄糖在缺血再灌注时的 变化。本实验应用微透析活体取样技术与实时电化 学检测的方法相结合,连续、实时监测肾热缺血再灌 注过程中细胞间液葡萄糖浓度的变化。 1 材料与方法 1 1 实验对象和分组 雄性新西兰大耳白兔2 0 只,体重2 1 2 5k g , 由北京大学医学部实验动物部提供。分为实验组和 对照组,各1 0 只。 1 2 仪器和实验装置 微透析取样采用1 0m m 长度微透析探针,购自 M i c r o b i o t e c h s eA B ( S t o c k h o l m ,S w e d e n ) 公司,其型 号为M A B7 8
20、 1 0 ( 直径0 6m m ,透析长度1 0m m ) , 所用微量注射泵为C M A1 0 0 ( C M AM i c r o d i a l y s i s A B ,S t o c k h o l m ,S w e d e n ) 。实时电化学分析系统采 用中国科学院化学研究所的方法H 5J ,该分析系统 主要由单壁碳纳米管( S W N T ) 修饰的薄层玻碳电极 及电化学工作站C H l 8 3 2 b ( C H I ,A u s t i n ,U S A ) 组成。 电化学测定采用薄层电解池三电极体系:葡萄糖脱 氢酶( G D H ) 修饰的碳纳米管电极作为工作电极,电 解
21、池出口的不锈钢管作为对电极,A g A g C l 作为参 比电极。工作电极电压为0 0V 。灌注透析液为复 方氯化钠溶液。连续实时电化学检测装置见图1 。 圈1微透析一电化学实时在线检测装置示意围 1 3 药品与试剂 葡萄糖、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 ( N A D + ) 、葡萄糖脱氢酶( G D H ) 、牛血清白蛋白均 购自S i g m a 公司;5 0 戊二醛溶液,亚甲基绿( M G ) , 万方数据 堂星丝型丛整盘查! Q 塑至! 旦箜! 鲞箜! 塑鱼! 也! 堕堕垫! ! ! 氆:丛! 竺! ! 壁塑:! 尘:! :坠:! 购自北京化学试剂公司。单壁碳纳米管( S W N T
22、 s ,平 均直径 2n m ,长度0 5 5 0 恤m ) 购自深圳纳米港 公司。复方氯化钠溶液购自北京双鹤药业。实验用 水为二次蒸馏用水。 1 4 实验步骤 1 4 1 制备工作电极将亚甲基绿单綮碳纳米管 混合物分散于水中,得到lm g m l 的悬浊液。取5 斗l 悬浊液滴涂到玻碳电极的表面,在室温下干燥 后,得到S W N T G C 修饰电极。然后将1 山1 0 m e , m l 的G D H 、lg l1 牛血清白蛋白和0 7w l 0 4 戊二醛混合,混合溶液滴涂在M G S W N T 修饰 电极上,室温干燥后得到G D H 修饰的碳纳米管玻碳 工作电极,固定在薄层电化学流动
23、池中,用来实时检 测葡萄糖。酶电极在不使用时放置在冰箱中4 下 保存。 1 4 2 测定葡萄糖标样电流响应将0 2 5 、0 5 、 1 、1 5 和2m m o l L 葡萄糖溶液由微量注射器经微 透析管路泵进薄层电解池内,通过电化学工作站测 出各自的电流响应,得出电流响应强度与其浓度之 间的线性方程。 1 4 3 手术步骤2 戊巴比妥按3 0m g k g 耳缘 静脉注射麻醉后,左侧卧位,于第1 2 肋缘下经右腰 部做长约2c m 斜切口,切开皮肤、皮下及肌层,打开 肾周筋膜,游离出右肾。实验组在肾门处分离出右 肾动脉和静脉,用无创伤动脉夹阻断肾动静脉6 0 r a i n 后开放血流,建
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