成人骨髓间充质干细胞体外分化为胰岛β细胞的初步研究.pdf
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1、成人骨髓间充质干细胞体外分化为胰岛 细胞的初步研究 王志伟1, 钱海鑫1, 王勇2, 陆玉华2 (1 .苏州大学附属第一医院 普外科, 江苏苏州2 1 5 0 0 6; 2 .南通大学附属医院 普外科, 江苏南通2 2 6 0 0 1) 摘要: 目的研究成人骨髓间充质干细胞体外诱导分化成为胰岛细胞的可能性。方法采用P e r c o l l分离液 和差异贴壁法分离纯化成人骨髓间充质干细胞, 在纤维连接蛋白包被, 含有表皮生长因子和血小板源性生长因子 B B的低浓度血清 (2 %F B S) 培养液中培养, 传代后用碱性成纤维细胞生长因子、B 2 7添加剂、 尼克酰胺诱导。放免 法检测培养液中胰
2、岛素, 双硫腙和免疫细胞化学进行鉴定, 并进行体外细胞功能测定。结果细胞诱导第二周逐 渐聚集成胰岛样细胞团, 开始分泌胰岛素, 双硫腙染色成猩红色, 免疫荧光显示细胞表达胰岛素, 体外葡萄糖刺激 胰岛素释放试验阳性。结论成人骨髓间充质干细胞可以在体外一定条件下实现向细胞转分化。 关键词: 间充质干细胞;骨髓;细胞;分化 中图分类号: 3 2 9 . 2 +3 文献标识码: A 文章编号: 1 6 7 3 - 0 3 9 9 (2 0 0 6) 0 3 - 0 3 7 8 - 0 4 T h eP r e l i L i n a r yS t u d yo nI n d u c t i o no
3、 f t h eA d u l tB o n eM a r r o w M e s e n c h y L a l S t e LC e l l s t oD i f f e r e n t i a t e i n t oB e t a - C e l l s i nV i t r o WA N GZ h i - w e i 1, Q I A NH a i - x i n 1,WA N GY o n g2, e t a l (1 . D e p t o fG e n e r a l S u r g e r y, t h eF i r s tH o s p i t a lA f f i l i
4、a t e d t oS u z h o uU n i v e r s i t y,J i a g n s uS u z h o u2 1 5 0 0 6; 2 . t h eH o s p i t a lA f f i l i a t e d t oN a n t o n gU n i v e r s i t y,J i a n g s uN a n t o n g2 2 6 0 0 1,C h i n a ) A b s t r a c r t:O b j e c t i v e T o s t u d y t h e f e a s i b i l i t yo f d i f f e
5、r e n t i a t i o no f a d u l t b o n em a r r o wm e s e n c h y - m a l s t e mc e l l s (M S C s) i n t oc e l l s i n v i t r o . M e t h o d s M S C sw e r e i s o l a t e d f r o ma d u l t b o n em a r r o wb y P e r c o l l ,p u r i f i e db yt h e i ra d h e s i v e n e s s,c u l t u r e d
6、o nf i b r o n e c t i nw i t he p i d e r m a lg r o w t hf a c t o ra n d p l a t e l e t - d e r i v e d g r o w t h f a c t o r B Ba n d 2 % f e t a l b o v i n e s e r u m,t h e d e s c e n d e d c e l l sw e r e i n d u c e d b y b a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r,B 2 7 s u
7、p p l e m e n t,n i c o t i n a m i d e . I n s u l i n i n t h em e d i u mw a s d e t e c t e db yR I A, t h e c e l l sw e r e i d e n t i f i e db yd i t h i z o n e (D T Z) a n d i m m u n o c y t o c h e m i s t r y,a n dt h ec e l l f u n c t i o nw a sd e - t e c t e d i nv i t r o . R e s u
8、 l t s T w ow e e k s a f t e r i n d u c t i o n,M S C s b e g a n t o g a t h e r a s c l u s t e r s s i m i l a r t o p a n - c r e a t i c i s l e t s,a n d s e c r e t e i n s u l i n,a n d c o u l db e s t a i n e dw i t hD T Z;t h e e x p r e s s i o n o f i n s u l i nw a s v i s u a l - i
9、z e db y i m m u n o f l u o r e s c e n c e,a n d t h e c l u s t e r sw e r e p o s i t i v e f o r t h e t e s t o f g l u c o s e - s t i m u l a t e d i n s u l i n s e - c r e t i o n i nv i t r o . C o n c l u s i o n T h e a d u l t b o n em a r r o wM S C s c a nb e i n d u c e d t od i f f
10、 e r e n t i a t e i n t oc e l l s u n d e r a c e r t a i nc u l t u r e dc o n d i t i o n i nv i t r o . K e yw o r d s:m e s e n c h y m a l s t e mc e l l s;b o n em a r r o w;b e t a c e l l s;d i f f e r e n t i a t i o n 近年来, 胰岛干细胞研究取得了一定的进展, 一 些学者将E S细胞、 胰腺导管上皮细胞、 小肠干细 胞 1 3 等在体外成功地诱导成为细胞。
11、最近A n - d r e e a等证实了 4骨髓干细胞在体内一定条件下能 够分化成为胰岛细胞。骨髓干细胞包括造血干细 胞、 间充质干细胞 (M S C s) 和内皮祖细胞。研究发 现, M S C s可以向多种组织细胞分化, 除了骨、 软骨 等中胚层细胞外, 还能够向外胚层如神经细胞以及 内胚层如肝细胞分化 5 。我们设想能否利用骨髓 M S C s在体外一定条件下分化成为胰岛细胞, 既可 以解决胰岛移植中供体紧缺的问题, 又能够通过自 体移植避免免疫排斥。 为此, 我们进行了一些相关 收稿日期: 2 0 0 5 - 0 9 - 1 2 作者简介: 王志伟 (1 9 6 1 -) , 男,
12、江苏南通人, 教授, 主任医师, 博士研究生, 研究方向为胰腺疾病的基础与临床。 873S U Z H O UU N I V E R S I T YJ O U R N A LO FM E D I C A LS C I E N C E2 0 0 6;2 6 (3) 的实验研究, 并取得了初步进展, 现报道如下。 1 材料和方法 1 . 1 材料细胞因子: 1 0n g m l表皮细胞生长因 子 (E G F, S i g m a) ,1 0n g m l血小板源性生长因子B B (P D G F - B B, R&D) ,1 0n g m l碱性成纤维细胞生长 因子 (b F G F, R&D)
13、 ,B 2 7添加剂 (G i b c o) ,1 0mM尼 克酰胺 (S i g m a) 。P e r c o l l液 (S i g m a) , 纤维连接蛋白 (F N, S i g m a) 。 1 . 2 方法 1 . 2 . 1 M S C s的分离和培养 骨髓来自健康成年 志愿捐髓者。常规从髂后上棘行骨穿抽取肝素化骨 髓5m l, DM E M稀释后, 与1 . 0 7 3g m l的P e r c o l l液 1 : 1加入离心管内, 进行密度梯度离心, 吸取单个核 细胞层, 接种于纤维连接蛋白 (F N) 包被的2 5c m 2 塑料培养瓶中, 加入扩增培养体系, 包含:
14、 6 0 %低糖 DM E M (DM E M - L G) 、 4 0 %M C D B 2 0 1、2 %F B S、 地塞 米松、 I T S、L -亚油酸牛血清白蛋白、2 -巯基乙醇、 非 必须氨基酸、 谷氨酰胺-青霉素-链霉素、 E G F、 P D G F - B B。置于3 7 ,5 %C O2, 饱和湿度下培养。 4 8h后全量换液, 以后每3 4d换液。细胞汇合达 8 0 %9 0 %后, 用0 . 2 5 %的胰蛋白酶- E D T A (S i g - m a) 消化, 按1 : 3比例进行传代。O l y m p u sP M - C B 3 0倒置相差显微镜观察。 1
15、 . 2 . 2 胰岛样细胞的诱导分化取第三代细胞汇 合达8 0 %后, 制成单细胞悬液, 按照1 0 4 c m 2密度 接种于F N包被的放有盖玻片的2 4孔培养板中, 加 入无血清的原有培养体系, 1 2h后, 上述培养液中 撤去E G F和P D G F - B B, 并加入1 0n gm l b F G F, 1 * B 2 7添加剂, 培养1周后撤去b F G F, 加入1 0mM尼 克酰胺, 继续培养。 1 . 2 . 3 双硫腙染色 5 0m g双硫腙 (D T Z) 加入5 m l DM S O溶解作为储备液, 取1 0m lP B S+0 . 1m l 上述液, 抽滤, 组
16、成染色液。取诱导的细胞团和未诱 导的M S C s, P B S液洗2次, 加入染色液,3 7 温育 1 5m i n, 镜检。 1 . 2 . 4 免疫荧光化学 4 %多聚甲醛固定3 0m i n, 空气干燥1 0m i n。P B S清洗2次, 0 . 5 %T r i t o nX - 1 0 0,3 7 ,1 0m i n。加入5 %正常羊血清封闭2 0 m i n, 吸去, 一抗 (1 : 7 5小鼠抗人胰岛素抗体)4 孵 育4 8h。P B S洗3次, 二抗 (1 : 1 0 0F I T C -山羊抗小 鼠I g G) 4 过夜 (避光) 。P B S洗3次, 甘油封固, 德 国
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- 成人 骨髓 间充质 干细胞 体外 化为 胰岛 细胞 初步 研究
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