原代神经元及PC12细胞用于药物体外急性毒性评价的实验研究.pdf
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1、3 6 9 论著 原代神经元及P C I2 细胞用于药物体外急性毒性评价的 实验研究+ 巫玮周捷潘雪刁潘琴 石磊 臧林泉一 ( 广东药学院药科学院新药筛选中心药理学教研室,广东 广州5 1 0 0 0 6 ) 摘要 【目的】研究原代神经元及P C I 2 细胞用以评价药物或化合物的急性毒性,以判断是否可以替代 动物实验,为建立稳定的体外高通量筛选化合物和药物的急性毒性评价体系奠定基础。【方法】原代分离培 养大鼠皮质神经元,传代培养大鼠类神经元细胞- - P C I 2 细胞,取1 7 种药物和化舍物,分别稀释不同浓度, 与上述两种细胞分别孵育2 4h ,与空白对照组比较,以M T T 法检测药
2、物化合物对细胞的抑制率。据此量效 曲线计算出I C 5 0 ,与大鼠口服L D 5 0 进行相关性分析。【结果】体外神经元的I C 5 0 与体内L D 5 0 相关性为:R 2 = o 7 2 5 3 ,P C I 2 细胞毒性检测结果的I C 5 0 与动物体内急性毒性I 。D 5 0 相关性为:R z 一0 6 4 4 1 ,二者均有明 显相关性。【结论】利用体外分离培养的原代神经元以及P C I 2 细胞,在短时间( 2 4 h ) 内可以评价药物或化舍 物的急性毒性,并可以预测化合物对人及动物的毒性,基本可以替代或减少动物实验。 关键词 细胞毒性,免疫;神经元;P C I 2 细胞
3、E x p e r i m e n t a lS t u d yo nP r i m a r yR a tC o r t i c a lN e u r o n sa n dP C I2c e l l sU s e df o rt h eE v a l u a t i o no f A c u t eC y t o t o x i c i t yW UW e i ,Z H O UJ i e P A NX u e - d i a o ,e ta l ( N o v e lD r u gS c r e e n i n gC e n t e r , D e p a r t m e n to fP h
4、a r m a c o l o g y ,G u a n g d o n gP h a r m a c e u t i c a lU n i v e r s i t y ,G u a n g z h o u5 1 0 0 0 6 ,C h i n a ) A b s t r a c t O b j e c t i v e T os t u d yt h ep r i m a r yc u l t u r eo fi s o l a t e dn e o n a t er a tn e u r o n sa n dt h ep 鲫s a g ec u l t u r eo f P C I 2c
5、e l l ss o 鹞t oe v a l u a t ea c u t ec y t o t o x i c i t yo fm e d i c i n e so rc o m p o u n d s 。a n dd e c i d ew h e t h e ri tt a i lr e p l a c ea n i m a l e x p e r i m e n t ,a n dp r o v i d et h ep r o o ff o re s t a b l i s h i n gt h eh i g ht h r o u g h p u ts c r e e n i n gm e
6、 t h o do fa c u t et o x i c i t yo fm e d i c i n e s o rc o m p o u n d s M e t h o d s P r i m a r yr a tc o r t i c a ln e u r o n sa n dP C I 2c e l l sw e r es t u d i e di nc u l t u r et oe v a l u a t et h e i rp o t e n 。 t i a lt ot h es c r e e n i n gf o rc y t o t o x i c i t y C o n
7、f l u e n tm o n o l a y e r sw e r ei n e u b a t e di nt h ea b s e n c eo rp r e s e n c eo fi n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n so ft e s tc h e m i c a l sf o r2 4h 。a n dt h eM T Ta s s a yW a su s e dt oa s s e s st o x i c i t y 。I n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n s ( I C
8、 5 0 ) w e r ee x t r a p o l a t e df r o mc o n c e n t r a t i o n - e f f e c tC L I r V O 皓a f t e rl i n e a rr e g r e s s i o na n a l y s i s S e v e n t e e nc h e m i c a l sw e r e t e s t e dw i t he a c he e l ll i n ea n dr a th a l fl e t h a ld o s e ( L D 6 0 ) w e r ec o m p a r e
9、 d R e s u l t s l I C 5 0o fn e u r o n si nv i t r ow a ss i g n i f i c a n t l yc o r r e l a t e dt oI D S 0o fn e u r o n si nv i v o ( R 2 = 0 7 2 5 3 ) I C 5 0b ye y t o t o x i e i t yt e s t i n go fP C I 2w a s a l s os i g n i f i c a n d yc o r r e l a t e dt oL D S 0o fa c u t ec y t o
10、 t o x i c i t yi na n i m a lb o d i e s ( R 2 = 0 6 4 41 ) C o n c l u s i o n P r i m a r yn e u r o n sa n d P C I 2c e l l sm a yb eU S e dt oe v a l u a t et h ea c u t ec y t o t o x i c i t yo fm e d i c i n e sa n dc o m p o u n d si nas h o r tt i m e ( 2 4 h ) ,a n dc a n p r e d i c tt h
11、 ec o m p o u n d st o x i c i t yt oh u m a na n da n i m a l s T h e r e f o r e 。i tt a i lr e p l a c eo rd e c r e a s ea n i m a le x p e r i m e n t s K e yw o r d s c y t o t o x i c i t y ,i m m u n o l o g i c ;n e u r o n s ;p c l 2c e l l s 中图分类号 R 一3 3 2 文献标识码 A 文章编号1 6 7 1 7 1 7 1 ( 2
12、0 0 9 ) 0 3 0 3 6 9 0 5 药物开发过程中,化合物和药物的毒性和安全 性评价起着举足轻重的作用,而以动物为基础的体 内安全性评价耗时耗力,费用巨大。2 0 0 7 年6 月, 欧盟委员会关于化合物审批注册的立法正式生效, 约3 00 0 0 种化合物有待检测,若全部使用动物实 验,估计约需39 0 00 0 0 只动物,所以,欧盟倡导使 用体外方法替代动物实验。化合物的急性毒性,即 引起动物死亡的原因,一般是急性神经毒性,其次是 对呼吸和心血管系统的毒性,尤其是作用于中枢神 经系统的药物更易发生神经毒性反应【z J 。因此,评 价药物的神经毒性可用神经元或者类神经元肿瘤细
13、胞P C I 2 来代替动物试验。此外,利用培养的细胞 体外评价化合物毒性,可以同时对多种化合物或者 候选药物进行筛选测试,这样可达到高通量、省时、 经济,而且干扰因素大大减少,在短时间内观察到化 合物对神经元细胞的毒性,甚至可以进一步研究药 * 基金项目 国家自然科学基金资助( N o3 0 5 7 2 1 7 7 ) ;教育部重点基金资助( N 0 2 0 8 1 0 5 )* * 通讯作者 万方数据 物或化合物产生神经元毒性的机制。有利于新药的 进一步优化、开发,获得高效低毒的化合物。 因此,本研究以原代神经元和P C I 2 细胞为模 型,对已知毒性的化合物或药物( L D 5 0 已
14、知) 进行体 外细胞毒性实验,并比较化合物药物对细胞I C 5 0 值与大鼠口服L D 5 0 值相关性,为建立更稳定、可靠 与动物试验体内数据相关性更好的体外安全性评价 标准奠定基础。 1 材料与方法 1 1 主要试剂与仪器帕罗西丁( 浙江临海金桥化 学有限公司) ,舒必利、硫酸阿米卡星、硫酸庆大霉 素、硫酸链霉素、青霉素( 均为S i g m a ) ,乳糖酸阿奇 霉素( 东北制药集团沈阳第一制药厂) ,地西泮( 天津 金耀氨基酸有限公司) ,氟哌啶醇( 上海旭东海普药 业有限公司) ,盐酸氯丙嗪( 上海和丰制药有限公 司) ,乳酸( 中国医药集团上海化学试剂公司,分析 纯) ,普罗帕酮(
15、 广州白云山明兴制药有限公司) ,苯 巴比妥( 广东邦民制药有限公司) ,氯霉素( 福建古田 药业有限公司) ,头孢噻肟钠( 广州白云山天心制药 有限公司) ,阿糖胞苷( 澳大利亚科鼎) ,西咪替丁( 常 州康普药业有限公司) 。2 5 e m 2 的细胞培养瓶 ( G r e i n e r ) ,9 6 孔细胞培养板( G r e i n e r ) ,倒置显微镜 ( 莱卡) 。 1 2 原代皮质神经元分离、培养2 4h 内新生S P F 级S D 大鼠( 购于广东中医药大学实验动物中心) 6 l o 只,无菌分离大脑皮质,以解剖液洗涤1 2 次,于解剖液( 9 0m L 无菌三蒸水+ 1
16、 0m I 。1 0 K r e b sb u f f e r + 0 8m L3 8 2 M g S 0 4 + 4 5m I ,胎 牛血清) 中用眼科剪剪碎脑组织至lm m 3 大小,移 入1 5m I ,离心管中,静置,去上清,加入4 倍体积的 0 2 5 胰酶,3 7 消化5m i n ,吸出上清液至装有少 量小牛血清的1 5m I 。离心管中,终止消化,反复数 次至消化完全。汇集全部液体过1 8 0 目筛后移入离 心管,8 0 0r m i n ,7m i n 。吸去上清,用含5m L1 0 胎牛血清( T B D ) 及5 马血清( G i b e o ) 的高糖 D M E M
17、培养液重悬细胞,细胞计数后调整细胞密度 5 1 0 5 ,以每孔l o o 弘I ,的体积接种于铺好多聚赖氨 酸( S i g m a ) 的9 6 孑L 板( 其中一孔置细胞爬片) 中,于 3 7 * ( 2 、5 C O z 、1 0 0 湿度的条件下进行常规培养。 2 4h 后以含2o A B 2 7 的神经元培养基( 含1 0 特级 胎牛血清及5 马血清的高糖D M E M 培养基) 换 液,4 8h 加入细胞分裂抑制剂阿糖胞苷( 1 0t z r n o l L ) ,以后每3d 换液1 次,7 1 0d 细胞状态最佳时 用于实验。 1 3P C I 2 细胞传代、培养 大鼠肾上腺嗜
18、铬细胞 瘤细胞P C I 2 ( 购于中山大学实验动物中心,由广东 药学院杨帆教授惠赠) 接种于2 5 e m 2 的细胞培养瓶 中,用含1 0 的优级胎牛血清( T B D ) 及双抗( 青霉 素、链霉素) 的D M E M 培养基于3 7 、5 C 0 2 、 1 0 0 湿度的条件下进行常规培养。待细胞处于对 数生长期时,用0 2 5 的胰酶消化,台盼蓝染色计 数,调整密度为5 1 0 5 个细胞r n L 的细胞悬液,以 每孔1 0 0 弘L 的体积接种于9 6 孔板,于C 0 :细胞培 养箱内孵育过夜。 1 4 神经元纯度鉴定培养在爬片上的细胞用 P B S 冲洗2 次,4 多聚甲醛
19、固定1h 以上,再用 P B S 冲洗2 次,将细胞爬片放入预热( 5 0 ) 的甲苯 胺蓝染液中染色2 0 3 0r a i n ,染色结束后用9 5 的 乙醇分色l 2 次,每次2 3s ( 在显微镜下控制分 色效果) ,分色结束后用双蒸水将乙醇冲洗干净,风 干后中性树胶封片。尼氏体是神经元的特征性结构 之一,尼氏体又称虎斑,存在于神经元胞体和树突 内,具有嗜碱性的特点,可以与甲苯胺蓝等碱性染料 结合。神经元比例计算公式为:神经元比例= 神经 元数细胞总数。 1 5 药物化合物毒性试验可溶解于培养基的药 物或化合物,用无血清培养基溶解调整至适宜浓度, 过滤除菌。难溶物以分析纯D M S o
20、 溶解,再以无血 清培养基稀释至适宜浓度( 使D M S O 含量不超过 1 ) ,过滤除菌。吸出原培养基,吸入以培养基配制 的各种受试物,每种受试物设6 个浓度( 3 复孔) ,每 孔1 0 0p L ,每板设6 个空白孔( 其中一孔为无细胞培 养基空白) ,于C O 。细胞培养箱内共孵育2 4h 。 1 6M T T 法检测化合物或药物对两种细胞的抑制 率细胞与药物或化合物孵育2 4h ,9 6 孔板每孔加 入1 0 肛L 的M T T ( 5m g m L ,S i g m a ) 溶液,于C O z 细胞培养箱内孵育4h 之后,弃上清,每孔加入1 5 0 弘L 的D M S O 。震荡
21、,于酶标仪上读取4 9 0n m 处的 吸光度( A ) 值,并计算细胞的相对活力。 1 7 数据分析处理以S P S S1 1 5 统计软件分别 计算以上各种药物对两种细胞I C 5 0 值( 蕈复实验3 次,取均值) ,并对其与L D 5 0 的相关性进行直线拟 合,求出相关系数R 2 。 2 结果 2 1 神经元纯度鉴定甲苯胺蓝染色后,在光学显 微镜高倍视野F 町见神经元胞质淡蓝色,尼氏体及 核仁明显呈深蓝色( 图1 A ,1 B ) 。随机取l O 个视野, 计神经元数和细胞总数,表明培养细胞中绝大多数 万方数据 为神经元。根据给出公式计算神经元比例,证实神 经元纯度达9 5 以上。见
22、图1 。 田1 光学显微镜下大鼠皮质神经元( 甲苯胺蓝染色,l A X2 0 0 ,1 B X 4 0 0 ) 2 2 大鼠皮质神经元染毒2 4h 形态学观察光镜 下见未染毒( 2 G ) 神经元胞体饱满透亮,突起之间形 成的网络清晰而完整。P e n i c i l l i n 浓度为2 3 9 5r a g m l 。( 2 G ) 以上时,大部分神经元胞体缩小,突起断 裂。随药物浓度降低,细胞形态趋于正常( 图2 A G ) 。通过观察神经元随化合物浓度变化而逐渐发 生的形态改变,可以直观地获知化合物毒性程度。 2 3P C I 2 染毒2 4h 形态学观察光镜下见未染 毒( 3 G )
23、 P C I 2 细胞形态良好,随药物( 例如苯巴比 妥) 浓度升高,细胞变圆,贴壁不良,细胞数量减少, ( 图3 A G ) 。由此可以观察到药物或化合物对 P C I 2 细胞的毒性程度。 万方数据 3 7 2 壁堂堕述堑壅! ! Q ! 望i 曼箜;! 鲞堑塑堡! i ! 曼! ! ! 丛! ! :;垒! ! :! 垡塑:熊1 2 4 药物或化合物I C 5 0 值与L D 5 0 值相关性分析 用M T T 法检测1 7 种受试化合物对原代皮质神 经元的细胞活力,分析所得的I C 5 0 ( m g m I 。) 值与其 相应的大鼠口服L D S 0 值( m g k g ,来源于化学
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