急性肺损伤大鼠体内明胶酶的活性变化及大豆胰蛋白酶抑制剂的干预效应.pdf
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1、1 1 7 0 中国药理学通报C h i n e s eP h a r m a c o l o g i c a lB u l l e t i n2 0 0 8S e p :2 4 ( 9 ) :1 1 7 0 3 急性肺损伤大鼠体内明胶酶的活性变化及 大豆胰蛋白酶抑制剂的干预效应 韦燕飞1 2 ,王继峰1 ,牛建昭1 ,游冬阁1 ( 1 北京中医药大学细胞与生化实验室。北京1 0 0 0 2 9 ;2 广西中医学院生理学教研室,广西南宁5 3 0 0 0 1 ) 中国图书分类号:R - 3 3 2 ;R3 2 2 3 5 ;R3 4 5 6 3 ;R3 9 4 2 ; R5 6 3 8 0 2
2、 2 :R9 7 7 3 文献标识码:A 文章编号:1 0 0 1 1 9 7 8 ( 2 0 0 8 ) 0 9 一1 1 7 0 0 4 摘要:目的探讨急性肺损伤大鼠体内基质金属蛋白酶2 ,9 ( M M P - 2 ,M M P - 9 ) 活性的变化以及大豆胰蛋白酶抑制剂 ( s o y b e a nt r y p s i np r o t e a s ei n h i b i t o r ,S B T I ) 的干预效应。方法 9 0 只S D 大鼠随机分为假手术组( S h a m 组,7 , = 3 0 ) 、内毒 素组( L P S 组,凡= 3 0 ) 、大豆胰蛋白酶抑制剂
3、组( S B T I 组,= 3 0 ) 。向I _ P S 和S T i l l 组大鼠气管内一次性注入0 3m l 含 L P S ( 6m g k g 。) 的生理盐水复制A L l 模型,假手术组大鼠 则在气管内一次性注入等量生理盐水。S B T I 组于造模前l 天腹腔注射给予1 0 0m g k g d “S B T I ( 溶于0 5m l 生理 盐水) ,假手术组和L P S 组大鼠腹腔注射等量的生理盐水,3 组动物同步于气管内L P S 灌注后d1 、d3 、d7 分别随机处死 l O 只。收集肺泡灌洗液,冰浴匀浆肺组织制备匀浆液, 一8 0 冻存。B r a d f o r
4、 d 法测定血浆蛋白含量和肺泡灌洗液中 收稿日期:2 0 0 8 0 4 1 3 ,修回日期:2 0 0 8 0 5 2 8 基金项目:国家自然科学基金资助项目( N o3 0 6 7 2 7 5 7 5 ) ;长江学者和 创新团队发展计划资助项目( N oI R T 0 4 1 3 ) ;科技部国际 合作计划资助项目( N o2 0 0 6 D F A 3 1 2 3 0 ,2 0 0 7 3 8 1 3 ) ;高等 学校创新引智计划资助项目( N oB 0 7 0 0 7 ) 作者简介:韦燕飞( 1 9 7 6 一) ,女,硕士。讲师,研究方向:中医药防治 肺纤维化,E - m a i l
5、 :w e i y a n f e i 1 6 3 c o r n ; 王继峰( 1 9 4 5 一) ,男,教授,博士生导师,研究方向:中医 药防治肺纤维化,通讯作者,T e l :0 1 0 - 6 4 2 8 6 9 9 5 ,E m a i l : w n 商i f e n g 1 2 6 c o r n 蛋白含量,计算肺通透指数;酶谱法测肺组织匀浆液和支气 管肺泡灌洗液上清中M M P - 2 、M M P - 9 酶活力及免疫组织化 学方法检测肺组织M M P - 2 、M M P - 9 蛋白表达情况;并进行肺 组织形态学观察。结果酶谱法显示:与h o S 组相比,S B T I
6、 组大鼠肺组织、支气管肺泡灌洗液中M M P - 2 、M M P - 9 活性明 显下降,在d7 活性变化明显,但M M P - 9 变化较M M P - 2 更明 显。免疫组化显示M M P - 2 、M M P - 9 在L P S 组肺组织细胞高 表达。S B T I 组大鼠肺组织M M P - 2 、M M P - 9 表达明显减弱。 肺组织病理提示S B T I 治疗组肺损伤病变局限且程度较轻, 肺泡内渗出明显小于L P S 组,P M N 和红细胞渗出较少。结 论M M P - 2 、M M P - 9 在L P S 诱导大鼠急性肺损伤中发挥重 要的作用S B T I 通过抑制M
7、 M P s 的分泌及激活,降低基底膜 的降解,减轻肺水肿及炎症反应,发挥肺保护的作用。 关键词:大豆胰蛋白酶抑制剂;急性肺损伤;基质金属蛋白酶 急性肺损伤( a c u t el u n gi n j u r y ,A u ) 是一种可 由多种因素诱发的临床常见危重病症,其发病机制 尚未阐明。基底膜损伤是A u 过程中重要事件。 明胶酶属于基质金属蛋白酶( m a t r i xm e t a l l o p r o t e i n 鹪e s ,M M P s ) 家族成员,是降解胶原的最重要酶 系,包括明胶酶一A ( M M P - 2 ) 和明胶酶一B ( M M P - 9 ) , 参
8、与许多生理病理过程。近年来研究结果表明忙J , 明胶酶在炎症相关性疾病( 如哮喘) 中发挥了重要 作用。明胶酶在A u 中的作用则研究甚少。本实验 t o m so fm o r p h i n i s t i cr a t sb yt h eo b s e r v a t i o no fp r a x i o l o g Y ,a n dc h a n g eo fe x p r e s s i o no fp r o t o o n c o g e n ec - j u ni n c a u d a t en u c l e u s ( C d ) a f t e rC C K - 8i
9、 n j e c t e db yi m m u n o h i s t o c h e m i s t r y M e t h o d s A n i m a lp r a x i o l o g ye v a l u a - t i o na n di m m u n o h i s t o c h e m i s t r yw e r eu s e d T h ei n f l u e n c eo fC C K - 8 ( 1 0m g L ,1 一) o nt h ew i t h d r a w a l s y m p t o m sa n dt h ee x p r e s s
10、i o no fe - j u no fm o r p h i n i s t i c r a t sw a so b s e r v e d R e s u l t s M o r p h i n i s t i cr a t sh a do b v i o u sp r a x i o l o g i c a lc h a n g e si nt h ew i t h d r a w a ls y m p t o m s c o m p a r e dw i t hn o r m a ls a l i n er a t s ;t h es c o r e so fw i t h d r a
11、 w a ls y m p t o m sd e c r e a s e dm o s to b v i o u s l ya tw i t h d r a w a l4 0ha f t e rC di n j e c t i o no fC C K - 8 :t h ee x p r e s s i o no f c - j u np r o t e i ni nC dd e c r e a s e di nm o r p h i n i s t i cr a t s ,b u t i n c r e a s e da f t e rC di n j e c t i o no fC C K
12、- 8 C o n c l u s i o n s M o d e l so fm o r p h i n o m a n i ar a t sw e r es u c c e s s f u l l yb u i h T h eC di n j e c t i o no fC C K - 8c o u l dd e c r e a s et h ew i t h - d r a w a ls y m p t o m so fm o r p h i n o m a n i ar a t s T h eC C K - 8 c o u l di n c r e a s et h ee x p r
13、e s s i o no fc - j u np r o t e i ni nC d T h e s ef i n d i n g ss u g g e s t e dt h a tC C K - 8c o u l dr e g u l a t et h e p r o d u c t i o no fw i t h d r a w a ls y m p t o m sa n dt h ee x p r e s s i o n o fc - j u np r o t e i ni nC do fm o r p h i n o m a n i ar a t s K e yw o r d s :m
14、 o r p h i n o m a n i a ;c h o l e c y s t o k i n i no c t a p e p t i d e ;c a u d a t en u c l e u s ;w i t h d r a w a ls y m p t o m ;c - j u np r o t e i n 万方数据 中国药理学通报C h i n e s eP h a r m a c o l o g i c a lB u l l e t i n2 0 0 8S e p ;2 4 ( 9 ) 11 7 1 拟建立脂多糖( L P S ) 气管滴注复制A L l 模型,探讨 大豆胰
15、蛋白酶抑制剂( s o y b e a nt r y p s i np r o t e a s ei n h i b i t o r ,S B T I ) 对大鼠A L l 肺组织和肺泡灌洗液中明胶 酶表达活性的影响。 1 材料与方法 1 1 动物分组与模型制备健康6S D 大鼠9 0 只, 体重( 2 2 0 1 0 ) g ,购自北京维通利华公司,动物许 可证号:S C X K ( 京) 2 0 0 3 2 0 0 4 号。随机分为假手术 组( s h a m 组,n = 3 0 ) 、内毒素组( L P S 组,r l , = 3 0 ) 、大 豆胰蛋白酶抑制剂组( S B T l 组,
16、1 7 , = 3 0 ) 。L P S 组和 S B T I 组大鼠气管内一次性注入含L P S ( 6m g k g 叫) 的生理盐水0 3m l 复制A L I 模型,假手术组 大鼠则在气管内一次性注人等量生理盐水。S B T I 组于造模前1 天腹腔注射给予1 0 0m g k g d 1 S B r 兀药液( 溶于生理盐水) 0 5m l ,假手术组和L P S 组大鼠腹腔注射等量的生理盐水。3 组动物同步于 气管内L P S 灌注后d1 、d3 、d7 分别随机处死1 0 只。支气管肺泡灌洗收集肺泡灌洗液,冰浴匀浆肺 组织制备匀浆液,一8 0 冻存。 1 2 试剂及仪器L P S
17、( 大肠杆菌0 1 2 6 :B 7 ) 、大 豆胰蛋白酶抑制剂( 批号:0 5 5 一B 5 ) 均购自美国S i g m a 公司;丙烯酰胺( A c r y ) 、十二烷基磺酸钠( S D S ) 、 T r i t o n X 1 0 0 、N ,N p 一亚甲基丙烯酰胺( B i s ) 、明胶蛋 白、考马斯亮蓝1 1 2 2 5 0 、明胶酶标准品等均购自美国 S i g m a 公司,B i o r a d 蛋白电泳仪购自美国伯乐公司。 2 检测指标和方法 2 1 肺通透指数( 1 u n gp e n e t r a t ei n d e x ,L P I ) B r a d
18、f o r d 法测定血浆蛋白含量和肺泡灌洗液( b r o n c h o a l v e o l a rl a v a g ef l u i d ,B A L F ) 中蛋白含量( g L 。1 ) ,计算肺通透指数( L P I = B A L F 蛋白含量血浆 蛋白含量) 。 2 2 肺泡灌洗液和肺组织匀浆M M P - 9 和M M P - 2 活性测定明胶酶谱法左肺行支气管肺泡灌洗,收 集约5m 1 支气管肺泡灌洗液,立即在4 E 时以50 0 0 r m i n 。1 离心1 0m i n ,取上清在一7 0 。C 冻存待用,临 用前浓缩1 0 倍( 浓缩管购自N i l l i
19、 p o r e 公司) ;参照 文献旧4 1 的方法制备肺组织匀浆提取液,取上清检 测M M P - 9 和M M P - 2 酶活性。取肺泡灌洗液1 0 斗l 、 肺组织匀浆上清液1 0 斗l ( 总蛋白含量均为1 0 “g ) , 分别加入1 3 、5 和5 灿l 上样缓冲液混匀,所有样品 上样量均为1 5 “l 。制备含有1g L 叫明胶的8 0g L 。1 丙烯酰胺分离胶和4 0g L 1 积层胶。将上述 样品加入积层胶的上样孔内,在电泳槽中于冰浴条 件下电泳3h ,电压为I O O V 。电泳完毕后取出凝胶 置于培养皿中,加入体积分数为0 0 2 5T r i t o nX 1 0
20、 0 1 0 0m l 振摇重复清洗6 次,每次5m i n 。再用反应缓 冲液冲洗3 次。将凝胶置于反应缓冲液3 7 温浴 培养1 8h 。用不含1 3 一巯基乙醇的考马斯亮蓝R - 2 5 0 染色液染色l h ,脱色后,照像。凝胶电泳经F u J i F i l m 图像处理,输入I m a g eM a s t e rV D S 凝胶成像分 析系统进行半定量分析。 2 3 肺组织M M P - 9 和M M P - 2 蛋白表达免疫组 织化学【5J ,肺组织石蜡切片常规脱蜡至水,采用标 记链霉素一卵白素一生物素法( S P 法) ,M M P - 2 兔 抗人多抗( S a n t a
21、C r u z 产品) 工作浓度为1 :5 0 ; I M P - 9 羊抗人多抗( S a n t aC r u z 产品) 工作浓度为1 :5 0 ,D A B 显色。以细胞质中有棕黄色颗粒沉着为 阳性,阴性对照片滴加P B S 代替一抗。 2 4 肺组织形态学观察右肺下叶经多聚甲醛固 定,石蜡包埋切片,H E 染色,封片,光镜下观察形态 学变化。 2 5 统计学处理采用S P S S1 1 0 统计软件,组间 比较采用方差分析。 3 结果 3 1 肺通透指数的变化L P S 组大鼠肺通透指数 从d1 起持续升高,到d7 未见回落,与假手术组比 差异有显著性;S B T I 组肺通透指数在
22、d3 和d7 明 显低于L P S 组,尤其到d7 差异明显( P 0 0 1 ) ,见 T a b1 。 T a b1 C h a n g e so f l u n gp e r m e a b i l i t yi n d e x ( x s ,n = 1 0 ,1 2 1 1 0 3 ) P 0 0 5 ,P 0 O l 绑s h a m ;4 P 0 0 5 ,槲P 0 O l 堪L P S 3 2 M M P - 2 、M M P - 9 活性变化与假手术组相 比:L P S 组大鼠肺泡灌洗液和肺组织匀浆样品M M P 一 2 活性从d1 起持续升高,到d7 未见回落;M M P -
23、 9 活性从3d 开始持续升高。与L P S 组相比,S B T I 组 大鼠肺泡灌洗液和肺组织匀浆M M P - 2 活性在d3 有所下降,到d7 下降更显著;肺组织匀浆N M P - 9 蛋白活性到d7 明显下降,肺泡灌洗液中M M P - 9 蛋 白活性虽有所下降,但不如肺组织匀浆M M P - 9 蛋白 活性下降显著,见T a b2 。 3 3 肺组织M M P - 2 、M M P - 9 免疫组织化学染色 N M P s 染色阳性信号为棕黄色颗粒,定位于胞质。 假手术组M N P - 2 在肺泡上皮细胞、支气管黏膜上皮 细胞、支气管壁平滑肌细胞呈弱阳性着色;正常肺组 织中,M M
24、P - 2 呈弱阳性表达,而M M P - 9 几乎不表 万方数据 11 7 2 中国药理学通报C h i n e s eP h a r m a c o l o g i c a lB u l l e t i n 2 0 0 8S e p ;2 4 ( 9 ) 达;L P S 气管滴注3d 后,M M P - 2 、M M P - 9 在肺泡上 皮细胞、支气管上皮细胞、巨噬细胞、肺间质细胞等 呈强阳性着色;7d 后,上述细胞染色进一步加深。 S B T I 组大鼠肺组织M M P - 2 、M M P - 9 表达明显减弱, 见T a b3 。 T a b2C l h a n g eo ft h
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