嗜酸性粒细胞提呈抗原对肺组织CD4细胞分化的影响.pdf
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1、书书书 论著文章编号: 1007 -8738 (2006) 02 -0261 -03 嗜酸性粒细胞提呈抗原对肺组织 CD4 + 细胞分化的影响 尹 琦1,施焕中2*,覃雪军2 (1柳州市第三人民医院检验科,广西 柳州 545007; 2广西医科大学附属医院呼吸和危重症监护中心,广西 南宁 530027 = ) 收稿日期: 2005 -04 -11; 修回日期: 2005 -06 -29 基金项目:国家自然科学基金资助项目 (No.30060079) 作者简介:尹 琦 (1964 - ) ,女,广西柳州人,主管技师. Tel:(0772) 3925107;*Corresponding autho
2、r 摘 要 目的:探讨嗜酸性粒细胞 (EOS) 对肺组织中的 CD4 + 细胞分化的影响。方法:以鸡卵清蛋白 (OVA) 致敏和 雾化吸入刺激 BALB/ c 小鼠以诱发气道的 EOS 在气道聚集后 将其分离纯化,然后与来源于致敏小鼠肺组织的 CD4 + 细胞 共同培养。在部分试验中加入抗 CD80 和 (或) 抗 CD86 mAb。 同时,将 EOS 注入致敏小鼠气道, 3 d 后,取出肺组织,并将 其制成细胞悬液进行培养。收集培养上清液,用 ELISA 测定 其中 IL-4、IL-5、IL-13 及 INF- 的含量。结果:在和 EOS 体 外共同培养的条件下,肺组织 CD4 + 淋巴细胞
3、产生 IL-4、IL- 5、和 IL-13 等 Th2 类因子, 但不产生 INF- 等 Th1 类因子; 抗 CD80 和 (或) 抗 CD86 mAb 可以明显抑制 Th2 类细胞因子的 产生。将 EOS 注入致敏小鼠气道后,同样在体内能激发肺组 织 CD4 + 活化,产生 Th2 细胞因子 IL-4,IL-5,IL-13,但不产 生 INF-,与体外结果相似,抗 CD80 和 (或) 抗 CD86 mAb 可 以抑制 EOS 在体内的抗原提呈过程。结论:EOS 细胞在体内 或体外均能摄取和处理抗原,激发 CD4 + 的 Th2 反应。 关键词 嗜酸性粒细胞;CD4 + 细胞分化;抗原提呈
4、细胞; 肺组织 中图分类号 R562. 2 文献标识码 A 多年来,嗜酸性粒细胞 (EOS) 细胞在过敏反应 中的作用一直是许多学者关注的焦点 1。在传统的 观念中,EOS 仅作为一个效应细胞,通过释放颗粒蛋 白和前炎症因子,在过敏性疾病及一些寄生虫感染 中发挥重要作用。然而许多研究已经证明,EOS 的 作用不仅仅如此。近年来的研究表明,EOS 细胞具 备抗原提呈细胞的基本条件,能将抗原提呈给 T 淋 巴细胞,以调控 Th 细胞的免疫反应,促进 CD4 + 细 胞的分化;研究还发现,无论在体内或体外,气道 EOS 均可作为抗原提呈细胞 (APC) ,将抗原信息提 呈给局部引流淋巴结的 CD4
5、+ 细胞,促使其增殖,向 Th2 细胞分化,产生淋巴因子 IL-4、IL-5、IL-13,不 产生 INF-,而且 EOS 的抗原提呈作用必须依赖 CD80 和 CD86 2。本研究旨在探讨气道 EOS 细胞提 呈抗原对肺组织 CD4 + 淋巴细胞分化的影响,从而进 一步证明 EOS 细胞在过敏性疾病中的重要作用。 1 材料和方法 1.1 材料 6 8 周龄雌性 BALB/ c 小鼠,购自广西医科大动 物实验中心。雾化器,DeVibiss Crop 为 Somerset. PA 公司产品。 磁性活化细胞分离系统 (MACS) 均为 Miltenyi BiotecGmbH, Bergisch G
6、Ladbach,Germany 产品;酶标仪为美国 Bio-Rad 公 司产品。OVA、Al (OH) 、Percoll、过敏原、Sephadex G-10 柱 均为 Sigma Chemical Co,St,Louis MO 公司产品。RPMI1640 培养液、重组小鼠 GM-CSF,均为 GIBCO Invitrogen Co,Carls- bad,CA 产品;抗小鼠-CD80 mAb、抗小鼠-CD86 mAb、大鼠 IgG2a 对照蛋白,购自于 PharMingen,San Diego,CA;小鼠 IL- 4、IL-5、INF- 检测试剂盒,PharMingen,SanDiego,CA
7、产品; 小鼠 IL-13 检测试剂盒,R&D System,Minneapolis,MN 产品。 1. 2 方法 1. 2. 1 EOS 的纯化 BALB/ c 小鼠气道 EOS 的准备和纯化以 及鸡卵清蛋白 (OVA) 致敏 CD4 + 细胞分离的方法详见参考文 献 3, 4 。 1. 2. 2 肺组织致敏 CD4 + 细胞的获取 用肝素盐水通过右 心,灌洗肺组织,直到将肺大静脉内的血液冲掉干净。将肺 组织从胸腔剥离,用剪刀剪碎,放入含有30 mg/ L DNAse-l 和 1. 5 105/ L 过敏原的 RPMI1640 培养液中,37 持续轻摇震 动培养 35 min。将肺组织碎片碾磨
8、并通过 SS80 筛网,用不含 钙/ 镁的 PBS 液清洗2 次,并将滤过液通过 Sephadex G-10 柱, 以剔除巨噬细胞。然后将通过 SephadexG-10 柱的肺细胞滤过 液与包被抗-CD4 mAb 的微小磁珠共同孵育。利用 Miltenyi Biotecmagnetically 的 “正向选择作用” 分离出高纯度 ( 97%) OVA 致敏的 CD4 + 细胞,成活率 98%。在显微镜下观察已 确定不含巨噬细胞。 1. 2. 3 体外 EOS 细胞对肺组织 CD4 + 分化影响的实验 将纯 化的肺组织 CD4 + 细胞与纯化的 BALF 来源的 EOS 细胞离心 取沉淀,用 R
9、PMI1640 培养液将上述细胞密度分别调整到 1 109个/ L 和 5 108个/ L,按以下实验组 (每组设 6 孔) 分别加 入到含 RPMI1640 的48 孔平底培养板上: : 肺组织 CD4 + 细 胞;:肺组织 CD4 + 细胞 + 纯化的 EOS 共同培养;:前述 共同培养液加入 OVA (200 mg/ L) 组;:EOS 组 (对照 1) ; :EOS + OVA 组 (对照 2) 。为观察是否需要 B7 协同信号的 参与,又设:在上述共同培养液中加入抗小鼠 CD80 mAb (16- 10AI, 10 mg/ L) 、和 (或) 抗 CD86 mAb (GI1, 10
10、mg/ L) 、或对 照大鼠 IgG2a (10 mg/ L) 共计 4 个组。所有 EOS 培养加入 5 g/ L 重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,用于维持 EOS 细胞的存活。以上实验均在 37、50 mL/ L CO2条件下 培养 4 d 后,收集不含细胞的上清液并冻存于 -70液氮中。 162ISSN1007 -8738 细胞与分子免疫学杂志 (Chin J Cell Mol Immunol) 2006, 22 (2) 1. 2. 4 体内 EOS 细胞影响肺组织 CD4 + 分化的实验 用 10 g OVA 加 1 mg AL (OH) 3经气道致敏小鼠。2 wk 后,在 溴乙
11、醇 (250 g/ kg) 轻度麻醉下以无菌操作暴露气管,将 1 106个来自 OVA 致敏和刺激小鼠的气道 EOS (悬于 50 L PBS) 以 1 mL 注射器缓慢注入气管。同时给部分试验组小鼠 气道注射死的 EOS 细胞。在给致敏小鼠注入细胞 1 d 和 2 d 后,按试验要求将小鼠分为注射抗 CD80 mAb (100 g) 组、抗 CD86 mAb (100 g) 组,和抗 CD80 + 抗 CD86 mAb (共200 g) 组,分别从小鼠尾部静脉注射相应的抗体;对照组注射大鼠 IgG2a (100 g) 。3 d 后,按1. 2. 2 方法制备肺组织 CD4 + 细胞 悬液。将
12、制备的肺 CD4 + 细胞 (2 109个/ L) 按以下试验组分 别置于含 RPMI1640 培养液的 48 孔细胞培养板。 (1) 气管注 入死的 EOS 细胞的小鼠肺 CD4 + ; (2) 气管注入死的 EOS 细 胞的小鼠肺 CD4 + + OVA; (3) 气管注入活的 EOS 细胞的小鼠 肺 CD4 + ; (4) 气管注入活的 EOS 细胞的小鼠肺 CD4 + + OVA; (5) 气道注入活的 EOS 细胞,静脉注射抗 CD80 mAb 组 小鼠肺 CD4 + 细胞; (6) 气道注入活的 EOS 细胞,静脉注射抗 CD86 mAb 组小鼠肺 CD4 + 细胞; (7) 气道
13、注入活的 EOS 细胞 后,静脉注射抗 CD80 mAb + 抗 CD86 mAb 组小鼠肺 CD4 + 细 胞; (8)气道注入活的 EOS 细胞,静脉注射大鼠 IgG2a (100 g)的对照组小鼠肺 CD4 + 细胞;以上各试验组在上述 条件下培养2 d,然后收集培养上清液冻存于 -70待测其中 细胞因子的含量。每个试验组设 6 个复孔。 1. 2. 5 细胞因子的 ELISA 检测 上述实验及对照各组上清 液的 IL-4、IL-5、IL-13 和 IFN- 的含量均采用酶联免疫吸附 法 ELISA 检测。操作按产品说明书进行。 1. 2. 6 统计学分析 运用 SPSS 软件进行分析。
14、所有数据以 x s 表示,各组间资料比较采用配对 t 检验以及方差分析和 q 检验。 2 结果 2. 1 EOS 细胞在体外对肺组织 CD4 +分化的影响 经4 d 的 体外培养后,单独培养的肺组织 CD4 + 细胞不论是否加入外 来特异抗原 (OVA) ,其上清液中均不含 IL-4、IL-5、IL-13 和 IFN-;与 OVA 致敏的 EOS 共同培养的 CD4 + 细胞产生大量 IL-4、IL-5、和 IL-13,但 IFN- 的含量很低;如再在该共同培 养体系中同时加入 OVA 后,IL-4、IL-5 和 IL-13 的含量增加 非常显著 (P 0. 05, 表1) 。单独对 EOS
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- 酸性 粒细胞 抗原 组织 CD4 细胞 分化 影响
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