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1、第1 7 卷第6 期 2 0 0 8 年1 2 月 激光生物学报 A C T AL A S E RB I O L O G YS I N I C A V 0 1 1 7N o 6 D e c 2 0 0 8 基础研究 激光对珠子参愈伤组织诱导影响的研究 柴瑞娟1 ,王玉良2 ,努尔巴依阿不都沙勒克3 ,唐俊1 ( 1 安徽工程科技学院生化系,安徽芜湖2 4 1 0 0 0 ;2 安徽科技学院生物系, 安徽凤阳2 3 3 1 0 0 ;3 新疆大学资源环境科学学院,新疆鸟鲁木齐8 3 0 0 4 6 ) 摘要:通过不同激光功率密度和处理时间处理珠子参植株,然后分别用珠子参的茎和叶做外殖体进行愈伤
2、组织诱导。结果表明,不经激光处理,珠子参茎和叶的愈伤组织诱导率分别为4 5 3 和0 7 。经激光处理 后,珠子参茎和叶愈伤组织诱导率分别最高达到了9 2 0 和6 7 。经t 检验,激光处理后,外殖体的愈伤组 织诱导率与对照相比达到了显著性差异,表明激光处理有助于珠子参愈伤组织的诱导。 关键词:激光;珠子参;愈伤组织;t 检验 中图分类号:Q 9 4 4 6 文献标识码:A 文章编号:1 0 0 7 7 1 4 6 ( 2 0 0 8 ) 0 6 - 0 7 3 9 - 0 5 L a s e rI m p a c to nC a l l u sI n d u c i n go fP a n
3、 a xj a p o n i c u sv a r m a j o r C H A IR u i - j u a n l ,W A N GY u 1 i a n 9 2 ,N U R B A Y A b d u s a l i h 3 ,T A N GJ u n l ( 1 D e p a r t m e n to fB i o c h e m i s t r yE n g i n e e r i n g ,A n h u iU n i v e r s i t yo fT e c h n o l o g ya n dS c i e n c e ,W u h u2 410 0 0 ,A n h
4、 u i ,C h i n a ; 2 D e p a r t m e n to fB i o l o g y ,A n h u iS c i e n c ea n dT e c h n o l o g yU n i v e r s i t y ,F e n g y a n g2 3 3 1 0 0 ,A n h u i ,C h i n a ; 3 C o U e g eo fR e s o u r c ea n dE n v i r o n m e n tS c i e n c e ,X i n j i a n gU n i v e r s i t y ,U r u m q i8 3 0
5、0 4 6 ,X i n j i a n g ,C h i n a ) A b s t r a c t :T h et e s tm a t e r i a lw a sP a n a xj a p o n i c u sv a t m a j o r W es t u d i e di tb yH e N el a s e rw i t hd i f f e r e n tp o w e rd e n s i t y a n dt i m ea n dt h e ni n d u c e dc a l l u s T h ee x p l a n t sw e r es t e ma n d
6、l e a fo fP j a p o n i c u sv a r m a j o rs e p a r a t e l y T h er e s u l t s s h o w e dt h a tr a t eo fc a l l u si n d u c t i o no fs t e mw i t h o u tl a s e rw a s4 5 3 a n dl e a f 8w a s0 7 B u tr a t eo fc a l l u si n d u e t i o n w a sh i g h e ra f t e rt h em a t e r i a lW e l
7、ei r r a l i a t e dw i t hl a s e r T I I e yw e r e9 2 0 ( s t e m ) a n d6 7 ( 1 e a f ) A n da n a l y s i s 陀- s u i t s ( tt e s t ) w e r er e m a r k a b l e K e yw o r d s :l a s e r ;P j a p o n i c u sv 盯m a j o r ;c a l l u s ;tt e s t 珠子参( P a n a x j a p o n i c wv a t m a j o r ) 为五加科
8、人 参属植物,生于山坡竹林下或杂木林中阴湿处。分 布于河南、湖北、安徽、陕西、宁夏、甘肃、四川、贵州、 云南、西藏等省区,具有活血散瘀、补血止血、消肿止 痛之功效,是我国传统名贵中药材。 目前有学者对珠子参做了部分研究,如珠子参 水提液体外抑制人肝癌细胞和小鼠肝癌细胞的生 长、并可以诱导人体外肝癌细胞和小鼠肝癌细胞凋 亡的研究i 2 刮;珠子参总皂苷的提取工艺的研究【4 , 等。目前的研究都是以珠子参为供试材料,但珠子 参野外资源有限,限制了珠子参的开采和利用,因此 希望通过植物细胞培养来获得其有效成分”剖。 目前,通过愈伤组织来获得植物细胞是最常用 的方法,如何能获得生长迅速且生长良好的愈伤
9、组 织细胞是植物细胞培养的首要问题,本文是首次利 用激光处理珠子参植株,然后进行愈伤组织诱导。 收稿日期:2 0 0 8 - 0 4 - 2 6 ;修回日期:2 0 0 8 - 1 0 - 1 8 基金项目:国家重点基础研究发展规划资助项目( G 1 9 9 9 0 4 3 5 0 8 ) ;安徽工程科技学院青年科研基金项目 ( 2 0 0 3 Y Q 0 0 4 ) ;安徽工程科技学院青年教师科研资助项目( 2 0 0 8 r 2 r 0 0 4 ) 作者简介:柴瑞娟( 1 9 7 5 一) ,硕士,讲师,主要从事植物生物技术方面的研究。( 电子邮箱) e h a i m i j u a n
10、 1 6 3 c o r n 万方数据 7 4 0激光生物学报 第1 7 卷 许多研究表明,激光对组织有很丰富的生理作用【9 】, 如促使作物增产,提高植物的光合效率、根尖有丝分 裂频率等0 | 。但目前国内有关激光对珠子参愈伤 组织诱导的影响还未见报道,因此本研究可以为珠 子参细胞培养获得其有效成分提供一定的依据。 1 材料和方法 1 1 材料 珠子参采于安徽鹞落坪国家级自然保护区。 1 2 方法 1 2 1 材料处理珠子参植株分成两组( 分别标 为处理组和对照组C K ) ,处理组用激光处理,激光器 光束波长为6 3 2 8n m ( 夜间处理,避免杂光干扰) , 光斑直径为2m m 。环
11、境温度为2 0 一2 3 。激光 的焦距到植株顶端的距离为1 5 0c m 。 第一组激光功率密度为5m w 、1 0m W 、1 5m W 、 2 0m W 、2 5m W 、3 0m W ,每天照射5m i n ,连续照射3 天,接种。C K 组无激光处理,作为对照组。 第二组激光功率密度为1 5m W ,照射时间分别 为3r a i n ,4r a i n ,5r a i n ,6r a i n ,7r a i n ,8m i n ,连续照射3 天,接种。C K 组无激光处理,作为对照组。其余条 件两组处理均相同。 1 2 2配制M S 培养基1 附加激素为2 0m g L 2 4 -
12、D + 0 2m g L6 - B A 1 2 3 接种以珠子参( 处理组和C K 组) 的叶和 茎为实验材料进行愈伤组织的诱导,每组接种5 0 个 外植体。重复3 次。外殖体在光照培养箱中培养, 培养条件为每天光照1 0h ,培养温度为2 3 。 愈伤组织的诱导率= ( 形成愈伤组织的材料数 总接种材料数) 1 0 0 2 试剂与仪器 2 1 试剂 硝酸钾、硝酸铵、硫酸镁、盐酸吡哆素、烟酸、肌 醇等,均为分析纯。 2 2 仪器 J D 大型激光器、超净工作台、灭菌锅、光照培 养箱等。 3 结果与讨论 3 1 激光对珠子参叶愈伤组织诱导的影响 表1 中,经t 检验,激光处理5m W ,5r a
13、 i n 组与对 照无差异,其余处理组与对照均有显著性差异( P 0 0 1 ) ,表明控制激光处理时间,变动激光处理强度 的实验条件下,可以显著提高珠子参叶愈伤组织的 诱导率。诱导珠子参叶愈伤组织的最佳激光功率密 度是2 5m W 。 表2 中,经t 检验,所有激光处理组与对照均有 显著差异( P 0 0 1 ) ,表明控制激光处理强度,变动 激光处理时间的实验条件下,可以显著提高珠子参 叶愈伤组织的诱导率。诱导珠子参叶愈伤组织的最 佳激光处理时间是7r a i n 。 表1 和表2 实验结果表明,经过激光处理,珠子 参的叶愈伤组织诱导率比对照( 不经激光处理) 珠子 参叶愈伤组织诱导率均有
14、所提高。 3 2 激光对珠子参茎愈伤组织诱导的影响 表3 可以看出,控制激光处理时间,变动激光处 理强度的实验条件下,除处理组5m W 幸5m i n 和 3 0m w 木5r a i n 外,其余处理组与对照相比均有显著 性差异,其中1 5m W 幸5m i n 处理组与对照相比差异 极显著( P 0 0 1 ) ,剩余组差异显著( P 0 0 5 ) 。表 明适当的激光处理可以显著的提高珠子参茎愈伤组 织诱导率,诱导珠子参茎愈伤组织的最佳激光功率 密度是1 5m W 。 表4 可以看出,控制激光处理强度,变动激光处 理时间的实验条件下,激光处理可以显著的提高珠 子参茎愈伤组织诱导率。其中1
15、 5m W 幸5m i n 和 1 5m W 水7r a i n 处理组与对照差异极显著( P 0 0 1 ) 。1 5m w 簟4r a i n 和1 5m W 母8r a i n 处理组与 对照差异显著( P 0 0 5 ) 。只有1 5m W 宰3m i n 处理 组与对照差异不显著。诱导珠子参茎愈伤组织的最 佳激光处理时间是5r a i n 。 表3 和表4 实验结果表明,经过激光处理,珠子 参的茎愈伤组织诱导率比对照( 不经激光处理) 珠子 参茎愈伤组织诱导率均有所提高。 3 3 珠子参茎与叶愈伤组织诱导率比较 从实验结果可以看出,不经激光处理,珠子参对 照组的茎愈伤组织诱导率比珠子
16、参叶愈伤组织诱导 率高,经统计分析,差异极显著( P 0 0 1 ) 。在同样 激光处理条件下,珠子参茎的愈伤组织诱导率也均 比珠子参叶愈伤组织的诱导率高( P 0 0 1 ) 。在分 别控制激光处理强度,变动激光处理时间和控制激 光处理时间,变动激光处理强度的实验条件下,珠子 参茎和叶的愈伤组织诱导率差异也极显著 万方数据 第6 期柴瑞娟等:激光对珠子参愈伤组织诱导影响的研究7 4 l ( P 0 0 1 ) 。表明无论是否经过激光处理,珠子参 不同外殖体愈伤组织诱导能力不同,茎比叶更容易 诱导出愈伤组织。 3 4 愈伤组织生长 珠子参叶诱导出的愈伤组织开始为淡黄色,大 约1 5 天后变为褐
17、色,1 个月后死亡,且生长缓慢,激 光处理与对照组之间没有明显差别。珠子参茎诱导 出的愈伤组织开始也为淡黄色,生长较快,大约2 0 天后变为淡绿色。同时,相同生长时间下( 3 0 天) 。 激光处理后的茎愈伤组织( 图1 ) 生长速度均较对照 组( 图2 ) 快,处理组茎愈伤启动大约在接种后l O 天, 对照大约需1 7 天。 表l 激光处理5m i n 后珠子参叶的愈伤组织诱导 T a b 1R a t eo fc a l l u si n d u c t i o no fl e a f5m i nt r e a t e db yl a s e r 表3激光处理5m i n 后珠子参茎的愈伤
18、组织诱导 T a b 3R a t eo fc a l l u si n d u c t i o no fs t e m5m i nt r e a t e db yl a s e r 万方数据 7 4 2激光生物学报第1 7 卷 4结论 图1激光处理后茎的愈伤组织 F i g 1 C a l l u so fs t e mb yl a s e r 通过激光处理珠子参植株,以珠子参茎和叶做 外殖体进行愈伤组织诱导。对于外殖体叶,无论是 否经过激光处理,愈伤组织诱导率都很低;同样处理 条件下外殖体茎的愈伤组织诱导率较叶的都高,表 明外殖体茎要比叶更容易诱导出愈伤组织。在本实 验条件下,激光诱导的最
19、佳剂量和最佳处理时间对 于珠子参茎和叶是不同的,分别为茎:1 5m W 木5 m i n 。叶:2 5m W 木7m i n ,表明茎对激光处理比叶更敏 感。同时激光处理过的珠子参茎愈伤组织诱导率 比对照组要高( 达到了显著水平) ,并且愈伤组织的 生长比对照更快。说明激光有助于珠子参茎愈伤组 织的诱导和生长。 本研究表明激光有助于珠子参茎愈伤组织的诱 图2 对照组茎的愈伤组织 F i g 2 C a l l u so fs t e mw i t h o u tl a s e r 导和生长。经激光处理后,珠子参茎愈伤组织启动 更快,生长状况更好,说明激光有助于获得生长旺 盛,用于细胞悬浮培养的
20、植物细胞。同时,激光处理 属于物理方法,较化学方法 1 2 川更安全,更有利于植 物有效化学成分的利用。同时,本研究不仅为珠子 参的利用提供了一条新的途径,也为其他通过细胞 悬浮培养获得有效成分的材料的研究提供了一定的 理论依据。 R e f e r e n c e s 1 段径云,陈瑞明珠子参对血液和造血功能的影响 J 西 北药学杂志,1 9 9 6 ,1 1 ( 2 ) :7 2 - 7 3 D U A NJ i n g y u n C H E NR u i m i n g E f f e c tO i lA n t i a n e m i ao fP a 一 ,w j a p l c I
21、 廿 J N o r t h w e s tP h a r m a c e u t i c a lJ o u r n a l 1 9 9 6 ,1 1 ( 2 ) :7 2 - 7 3 2 陈涛,陈龙飞,金国琴,等珠子参体外诱导人肝癌细胞凋 亡效应及机制研究 J 肿瘤2 0 0 6 2 6 ( 2 ) :1 4 4 1 4 7 万方数据 第6 期柴瑞娟等:激光对珠子参愈伤组织诱导影响的研究 7 4 3 3 4 5 6 7 8 】 C H E NT a o ,C H E NL o n g f e i 。J I NG u o q i n 。c ta 1 P a n a xj a p c u s v
22、 a tI n d u c e dA p o p t o s i so fH u m a nH e p a t o c a r c i n o m aC e l l si nv i t r o J T u m o r 2 0 0 6 ,2 6 ( 2 ) :1 4 4 1 4 7 胡卫,陈涛珠子参抑制小鼠肝癌及诱导细胞凋亡的研究 J 时针国医国药,2 0 0 5 。1 0 :1 0 7 3 - 1 0 7 4 H UW c i ,C H E NT a o S t u d i e so fP Jo nI n h i b i t i o no fP r o l i f e r a t i o n
23、0 fH 一( 2 2 ) C e l li nM i c ea n dI n d u c t i o no fA p o p t o s i s J 1 a s h i z h e n J M e d i c i n ea n dM a i e r i aM e d i c a lR e s e a r c h ,2 0 0 5 ,1 0 : 1 0 7 3 1 0 7 4 高培红,曹军毅正交实验法优选珠子参总皂苷的提取工 艺 J 陕西中医学院学报,2 0 0 6 2 9 ( 2 ) :6 6 - 6 8 G A OP e i - h o n g ,C A OJ u n y i E x t
24、r a c tT e c h n o l o g yS e l e c t i n gR h i - m nP a n a c i sM a j o r i sT o t a lS a p o n i nw i t hO r t h o g o n a lT e s t J J o u r n a lo fS M n n x iC o l l e g eo fT r a d i t i o n a lC h i n e s eM e d i c i n e 。 2 0 0 6 ,2 9 ( 2 ) :6 6 - 6 8 S E I T ZHU A n t h e c y a n i n s C
25、 O N S T A B E LF V A S I LIK C e l lC u l t u r ea n dS o m a t i cC e l lG e n e t i c so fP l a n t s M L o n d o n : A c a d e m i aP r e s s 1 9 8 8 :4 9 - 7 6 张小兵,曰静辉。李亚璞,等西洋参悬浮细胞发酵工艺研 究 J 生物技术通报,2 0 0 7 ,5 :1 8 8 1 9 3 Z H A N GX i a o b i n g ,Y A NJ i n g h u i ,L IY a p u ,e ta 1 S t u d i
26、 e s o n F e r m e n t a t i o no fS u p e n s i o nC e l so f 凡m q u i n q u e f o l i u m J B i a t e c h n o l o g yB u l l e t i n ,2 0 0 7 ,5 :1 8 8 - 1 9 3 韩健。戴均贵,崔亚君等长春花及银杏植物细胞悬浮培 养对青蒿素的生物转化研究 J 中草药,2 0 0 3 ,3 4 ( 2 ) : 1 6 6 1 6 8 H A NJ i a n ,D A IJ u n g u i ,C U IY a - j u n 。e ta 1 B i
27、o t r a n s f o r m a t i o no f A r t e m i s i n i nb yC l 砒,8 ,I m l ur o s e u s a n dG i n k g ob i l o b aC e l lS u p e n s i o nC u l t u r e s J C h i n e s eT r a d i t i o n a la n dH e r b a lD r u g s , 2 0 0 3 ,3 4 ( 2 ) :1 6 6 1 6 8 康强胜,李洪林,吴玉兰,等新疆紫草细胞生产阶段培养 中细胞生长及产物合成的研究I :悬浮培养 J 天然产
28、物 9 1 0 1 2 1 3 研究与开发2 0 0 3 ,1 5 ( 4 ) :3 3 4 - 3 3 6 K A N GQ i a n g - s h e n g ,L IH o n g - l i n ,W UY u - l a n e ta 1 S t u d yo n G r o w t ha n dP r o d u c tF o r m a t i o no fA r n e c b i aE u c h r o m aC e l li nS e e a n dS t a g eI :S u p e n s i o nC u l t u r e J N a t u r a lP
29、r o d u c tR e s e a r c h a n dD e v e l o p m e n t ,2 0 0 3 ,1 5 ( 4 ) :3 3 4 - 3 3 6 姚翠萍,张镇西激光与组织的相互作用 J 激光生物学 报,1 9 9 9 ,8 ( 2 ) :1 0 2 - 1 0 7 Y A O C u i p i n g Z H A N GZ h e n x i I n t e r a c t i o no fk r w i t h T i s - s u e J A c t sI M I s c rB i o l o g yS i n i c a ,1 9 9 9 。8 ( 2
30、 ) :1 0 2 1 0 7 朱新军,岳明激光对植物的作用及其机理 J 科技情报 开发与经济,2 0 0 6 。1 6 ( 4 ) :1 8 2 - 1 8 3 Z H UX i n - j u n Y U EM i n g T h eE f f e c to ft h ek ro nt h eP l a n t a n dI t sM e c h a n i s m 【J S e i - T e c hL r f f o r m a t i o nD e v e l o p m e n t E c o n o m y ,2 0 0 6 ,1 6 ( 4 ) :1 8 2 - 1 8 3 曹
31、孜义,刘国民实用植物组织培养技术教程 M 兰州: 甘肃科学技术出版社,2 0 0 1 :2 3 - 3 6 C A OZ i - y i 。U UG u o r a i n T e x b o u ko fP r a c t i c a lT e c h n i q u e so n P l a n sT i s s u eC u l t u r e M L a l l g h o u :G a n a nS c i e n c e & T e c h n o l o g y P r e s s ,2 0 0 1 :2 3 - 3 6 张东向李康。姚娜,等D M S O 和T w e e n
32、- 8 0 对黄芩悬浮细 胞系的影响 J 种子,2 0 0 7 ,2 6 ( 6 ) :2 1 - 2 3 Z H A N GX i a n g - d o n g ,L IK a n g ,Y A ON a ,e ta 1 E f f e c t so fD M S Oa n dT w e e n _ 8 0o nC e l lS u s p e n s i o nC u l t u r e so f S c u t e l a r ab a 一 c a e n s sC e o 喇 J s e e d ,2 0 0 7 ,2 6 ( 6 ) :2 1 - 2 3 陈军营。杨艳会,许海霞等植
33、物磺肽素( p h y t o s u l f o k i n e d ) 。对烟草B Y - 2 ”悬浮细胞增殖的促进作用 J 植物生 理与分子生物学学报,2 0 0 7 ,3 3 ( 1 ) :3 9 - 4 5 C H E NJ u n - y i n g ,Y A N GY a n h u i ,X UH a l x l a ,e ta 1 S t i m u l a - t o r yE f f e c to fP h y t o s u l f o k i n e - ao nt h eP r o l i f e r a t i o no f 。T o b a c c o B r i g h tY e l l o w2 ”S u s p e n s i o nC e l l s J J o u r n a lo fP l a n tP h y s i o l o g ya n dM o l e c u l a rB i o l o g y ,2 0 0 7 ,3 3 ( 1 ) :3 9 - 4 5 万方数据
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