大鼠门脉高压性胃病形成中胃黏膜诱导型一氧化氮合酶的表达及氨基胍的干预作用.pdf
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1、生堡堕压重羞銎查2 Q 鲤生! 旦笙! ! 鲞筮兰塑g ! 迪! 茎地里堂堂垦! i ! 迪生堕! 堕! ! ! :垒! 艘坠! 螋! :! ! ! :! ! :塑! :! 大鼠门脉高压性胃病形成中胃黏膜诱导型 一氧化氮合酶的表达及氨基胍的干预作用 王凝展玉涛史小林高福生谢新纪刘宾 【摘要】目的探讨大鼠胃黏膜诱导型一氧化氮合酶( i N 0 s ) 在门脉高压性胃病形成中的作用,以 及氨基胍( A G ) 的干预作用和机制。方法将5 4 只s D 大鼠随机分为对照组( n = 1 4 ) 、模型组( 凡= 2 0 ) 和A G 组( n = 2 0 ) 。模型组予每周2 次皮下注射4 0 c
2、c l 4 橄榄油溶液3m k g ,A G 组与模型组做相 同处理的同时予A G5 0m g k g - 。d - 1 饮用,对照组予每周2 次皮下注射橄榄油3m L k g 。每组再根据制 模时间分别分为6 周组及1 2 周组,共计6 组。分别观察各组大鼠胃黏膜病变情况,测定胃黏膜溃疡指数 及门静脉压力,应用免疫组化s A B c 法检测胃黏膜i N O S 的表达。结果模型组大鼠胃黏膜溃疡指数均明 显高于相应对照组( P 均 0 0 1 ) ,A G6 周及1 2 周组胃黏膜溃疡指数则明显低于模型组( P 0 0 5 ; P O 0 1 ) 。模型6 周及1 2 周组门静脉压力均较相应对
3、照组升高( P 0 0 5 ;P 0 0 1 ) ,A G6 周及1 2 周 组门脉压力均较相应模型组降低( P O 0 5 ;P 0 0 1 ) 。模型各组胃黏膜i N O s 表达均较相应对照组明显 升高( P O 0 1 ) ,A G 各组均较相应模型组水平明显下降( P O 0 1 ) 。结论门脉高压性胃病形成中的 不同阶段均出现胃黏膜i N 0 s 高表达,且逐步加重,i N O s 在门脉高压性胃病形成中可能起重要作用;A G 可明显减轻门脉高压性胃黏膜病变程度,其机制可能主要通过抑制胃黏膜i N O S 表达。 【关键词】肝硬化;门脉高压性胃病;诱导型一氧化氮合酶;氨基胍 【中图
4、分类号】R 3 3 2【文献标识码】A【文章编号】1 6 7 4 6 3 5 x ( 2 0 0 9 ) 0 4 一0 2 2 0 - 0 4 E x p 弛蟠I o no fi 耐u c m kn i t r i c d d es y 血a 辩妯g a s t r i cm 耻嘲i t h ed e V e l o p m e n to fp o r t a lh y p e r t e 璐i v e 静s t r o p a m y i n n 协a n d 血e j n t e r v e n n a le m c t0 f 锄洳g I I l m i d i n e肼G M n g ,
5、删地咖,5 珊x 洒 h ,翻O 凡- s J 比,l g ,脚勋够,删占讥D e p 口n 聊mo 厂G 打D e 哝,r o 幻彰,季打曙,俨n 舶甲玩f ,C 口p 如以肌缸 “跏彘岍毋,& 咖gJ D D 刀D ,吼i M c o 唧,霉幽塘口以b ,:u ,口流,E m 以:L6 钳 m e d r 眦正c D m 饥 【A b g 打a c t 】0 b j e c 廿V eT os t I I d yt l l ee x p 陀s s i o na n dm l eo fi n d u c i b l en i t r i co x i d es y n 山a s e ( i N
6、 0 s ) i ng 嬲- t r i cm u c o 姐i nt l l ep a t h o g e n e s i so fp o n a lh y p e n e n s i V eg a s t r o p a t h y ( P H G ) i nr a t s ,a n dl oi n v e s t i g a t et I I ei n t e r v e n - t i o n a le 如c to f 锄i n o g I I a n i d i n e ( A G ) ,a l e c t i v ei n h i b i t o ro fi N O S M e 恤
7、o d sF i f t y f o u rm a l eS Dm l sw e r er a n d o d yd i v i d e di n t oc o n t r D lg r o u p ( n = 1 4 ) ,m o d e lg I o u p ( n = 2 0 ) ,a n dA Gg r o u p ( ,l = 2 0 ) T h em o d e lg m u pw a s i n d u c e d b y4 0 C C l 4 o l i v eo i l l u t i o n ( 3m 肌g ,t w i c eaw e e k ) s u b c u t
8、a n e 叫s l y ,a n dt I l eA Gg m u pw a st r e a 刚 b yd r i n k i n g5 0m g k g 一1 d 一1A Gi l la d d i t i o nt ot h ei n j e c t i o no fC C l 4 H a l fo ft h e s el 丑t sw e 弛s a c r i f i c e da tt h e e n do fW e e k6a n dW e e k1 2 ,阳8 P e c t i v e l y I h em o r p h o l o g i c a la n dh i s t
9、 o l o g i c a lc h a n g e 8i ng 酗m cm u c o s aw e r e e V a l u a t e d T h eu k e ri n d e x ( U I ) o fg a s 研cm u c o 昭a n dp o r t a lv e n o u sp r e s s u r ew e r em e a s u r e d T h ee x p r e s s i o no f i N O Si ng a s t 矗cm u c o s aw a sd e t e c t e db yi m m u n o h i s t o c h e
10、m i c a lm e t h o d 8 R e s u I t sT h ee x t e n to fh i s t o l o g i c a lc h a n - g e 8 髓dt I I eU Io fg a s t r i cm u c o 腿i l Im o d e lg m u pw e r em o r e v e r e h i g h e rt l l a nt l l o s ei I lc o n t m lg m u p ( P O 0 1 ) , w l l i l et h eU Io fg 髓h i cm u c o s ai nA Gg m u pw
11、e r es i g n m c a n t l y1 0 w e rt l a nt l l a ti nm o d e lg m u p ( P 0 0 5 ;P 0 0 1 ) T h ep o n a lp 瑚舢陀i nm o d e lg r o u pw 聃s i g n i f i c a n d yh i g h e r 岫n 山a ti nc o n t m lg m u p ( P O 0 5 ) a n d 惴 s i 印i f i c 蛐d yh i g h e rt I l a nl h a t i nA Gg m u p ( P 0 0 5 ) n ee x p r
12、 e s s i o no fi N O Si ng a s 耐cm u c o s 8i nm o d e lg 0 u p 论著 D o I :l O 。3 7 6 0 c m a j i 8 1 6 7 4 6 3 5 X 2 0 0 9 0 4 0 0 7 作者单位:l 0 0 7 3 0 首都医科大学附属北京同仁医院消化内科( 王凝、展玉涛、高福生、刘宾) ,病理科( 谢新纪) ;首都医科大学生殖医学 中心( 史小林) 通信作者:刘宾。E - m a i l :L b 4 4 m e d 删I i L c o I I I c n 万方数据 主堡堕鏖萱羞盘盍! Q 塑玺! 旦筮! !
13、鲞筮! 塑! i ! ! 矍! 翌型坚垡! ! 堡! ! 塑! ! 型竺:叁! 醒壁! 鲤! :! ! ! :! ! :丛堡垒 w a ss i g n i f i c a n yh i g h e rt I l a nt I I a ti nc o n t r o lg r o u p ( P 0 0 1 ) a n dw 聃s i g n i f i c a n d yh i g h e r t h a nt l l a ti r IA Gg r o u p ( P 0 0 1 ) C o n c l u s t o n sT h ee x p r e 8 s i o no fi N O
14、Si I lg a s 试cm u s o s ar e m a r k a b l yi n c 舱a sw i t I lt l I ed e V e l o p m e n t o fc i 玎h o s i s ,w h i c hm a yp l a ya ni m p o n a n tm l ei nt h ed e V e l o p m e n to fP H G A Gm a y 陀m a r k a b l y 蛐e l i o m t el l l ed e g r e eo fP H G ,m a i n l yb yi n h i b i t i n gt l l
15、ee x p r e s s i o no fi N O Si ng 船伍cm u s o s 乱 【K e yw o r d s1c i r r h o s i s ;P o r t a lh y p e n e n s i v eg a s t r o p a t l l y ;I n d u c i b l en co x i d es y n t l l a 肫;A m i n o g I I 帅i d i n e 门脉高压性胃病( p o r t a lh y p e r t e n s i v eg a s t m p a t h y ,P H G ) 是肝硬化常见并发症,已成为肝
16、硬化重 度肝功能不全患者上消化道大出血的首位病因, 因此了解其形成机制、寻找有效治疗方法对临床工 作有重要意义。近年来一氧化氮( n i t r i co x i d e ,N O ) 在P H G 发生中的作用倍受关注,参与致病的N O 主 要由诱导型一氧化氮合酶( i n d u c i b l en i t r i co x i d es y n t h a s e ,i N O S ) 合成,而i N O S 是在病理状态下由内 毒素、肿瘤坏死因子- d ( t u m o rn e c m s i sf a c t o r - n , T N F o L ) 、干扰素一1 ( i n
17、 t e 血m n y ,l F N 一7 ) 及白细胞 介素1 ( i n t e d e u k i n 1 ,I L 一1 ) 等细胞因子刺激诱导 生成【2 引。氨基胍( 舢i n o g u a n i d i n e ,A G ) 是特异性 i N O S 抑制剂,有研究发现A G 对实验性门脉高压时 的高动力循环状态有改善作用【4 剖,但其对胃黏膜 i N O s 表达的作用及对P H G 有无防治意义目前尚缺 乏深入研究。本研究通过检测P H G 大鼠胃黏膜i N O S 的表达情况,探讨i N O S 在P H G 形成中的作用, 同时观察A G 是否具有干预作用及其可能机制。
18、 l 材料与方法 1 1 主要试剂 C C l 。及橄榄油购自北京化学试剂公司,A G 购自 美国S I G M A 公司,i N O S 浓缩型试剂、s A B C 试剂盒 及D A B 显色剂购自武汉博士德生物工程有限公司。 1 2 动物分组与模型制备 健康雄性s D 大鼠5 4 只,体重( 2 0 0 5 0 ) g , 由北京同仁医院实验动物中心提供。随机分为3 组: 模型组( n = 2 0 ) 予皮下注射4 0 C c l 。橄榄油溶液 3m L k g ,每周2 次;A G 组( ,l = 2 0 ) 与模型组做相 同处理的同时予A G5 0m g k g - 。d 。1 饮用(
19、 即予 0 1 A G 水溶液自由饮用) 1 ;对照组( n = 1 4 ) 予皮下注射橄榄油3m L k g ,每周2 次。分别于第6 周、1 2 周末随机处死各组半数大鼠。 1 3 门脉压力测定 氯氨酮4 0m g k g 腹腔注射麻醉后正中切口开 腹,以2 6 号套管针穿刺门静脉主干,接测压管,读 取门静脉压力( p o r t a lv e n o u 8p r e s s u r e ,P V P ) 值。正 常大鼠P V P 值大于1 6c mH 2 0 ( 1c mH 2 0 = 0 0 9 8 k P a ) 时认为存在门脉高压J 。 1 4 胃黏膜溃疡指数测定及组织标本制备
20、将胃沿大弯侧剪开,生理盐水冲洗后展平,按 G u t h 标准1 记录胃黏膜溃疡指数。将胃及肝脏放人 1 0 甲醛溶液中,常温石蜡包埋,连续4 斗m 切片行 H E 染色。 1 5 胃黏膜i N O S 免疫组化染色及图像分析 按S A B C 试剂盒说明书方法染色,一抗为兔抗 大鼠i N O SI g G 多克隆抗体,工作浓度l :2 0 0 ,P B S 为阴性对照,二抗为生物素化山羊抗兔I g G ,最后 以D A B 显色( 显微镜下控制反应时间约5m i n ) ,苏 木精复染,脱水、透明、封片。应用医学图像分析 管理系统测定i N O S 阳性反应产物染色强度,以光 密度值表示;测
21、量阳性反应产物的面积与其窗口面 积的比值,记为面密度值。每张切片随机选取1 0 个 视野,取其均值。 1 6 统计学分析 应用S P S S l l 5 统计软件进行统计学分析。数据 以均数标准差表示,计量资料的组间比较采用 检验。P O 0 5 为差异有统计学意义。 2结果 2 1 动物模型制备结果 经肝脏病理组织学证实,模型6 周组肝纤维化 形成;模型1 2 周组肝硬化形成( 图1 ) 。A G 组大鼠 肝硬化及肝纤维化程度均较相应模型组减轻。 2 2P V P 测定结果 模型6 周及1 2 周组P V P 较相应对照组均明显 增高( P 0 0 5 ;P 0 0 1 ) 。模型1 2 周
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