牙龈卟啉菌蛋白酶基因RGPA与RGPB蛋白酶区的克隆和表达.pdf
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1、3 4 0 旦堕匡堂至坚生Z 旦( 笙垫鲞筮! 塑!幽! 虹:y 尘:垫! :2 :趔:2 堂 牙龈卟啉菌蛋白酶基因r g p A 与r g p B 蛋白酶区的克隆和表达 石卓瑾1 ,严杰2 ,陈莉丽 摘要】 目的 克隆牙龈卟啉单胞菌( P o r # ,w m o n a sg i 愕如幽,P g ) r g p A 、r g p B 蛋白酶区,构建r g p A 、r g p B 蛋白酶区原核表达系 统。方法采用聚合酶链式反应( P C R ) 从P g A T C C3 3 2 7 7 菌株中扩增r g p A 、r g p B 蛋白酶区。T A 克隆后测定核苷酸序列构建 p E - F
2、 4 2 a 的r g p A r g p B 蛋白酶区表达载体。在E c o l iB L 2 1 D E 3 宿主菌中用不同浓度的I F F G 诱导其表达。结果所克隆的赡 A T C C3 3 2 7 7 菌株r g p A 、r g p B 基冈蛋白酶的核苷酸序列与报道的相应核苷酸序列间源性分别为9 8 9 、9 9 O ,氨基酸序列 同源性分别高达9 9 2 、9 9 1 。p b 汀4 2 a r g p A r g p B E c o l iB 1 2 1 D E 3 系统的蛋白表达量为细菌总蛋白的6 0 左右。结论 本研究成功地构建尸gr g p A 、r g p B 蛋白酶区
3、高效表达系统,为测定R g p A 、R g p S 免疫原性及作用提供I i i 提。 关键词牙龈卟啉单胞菌;r g p A ;r g p B ;牙龈素 中图分类号 R 3 9 4 2 文献标识码 A 文章编号1 0 0 3 9 8 7 2 ( 2 0 0 8 ) 0 7 - 0 3 4 0 - 0 4 M o l e c u l a rd o n i J l ga n de x p r e s s i o n0 fr g p Aa n dr g p Bp r o t e i n a s er e g i o ng e n e so fP o r p h 删g i n g i v a l i
4、 s S i l lZ h u o - j i n 。Y A NJ i e ,C H E NL i - l i ( D e p a r t m e n to f S t o m a t o l o g y ,T h eS e c o n dA f f t l i a t e dH o s p i t a l ,C o l l e g eo f M e d i c i n e ,Z h e j i a n gU n i v e r s i t y , 觑嘴旎础3 1 0 0 0 9 ,C h n a ) A b s t r a c t : O b j e c t i v e T oC l O N
5、 et h er g p Aa n dr g p Bp r o t e i n a s eg e n er e g i o n so fP o r p h y m m o n a sg i n g i v a l i s ( P g ) a n dt oc o n s t r u c tt h e i re x p r e s - s i o ns y s t e mv i ap E r 4 2 av e c t o r M e t h o d sT h er g p Aa n dr g p Bp r o t e i n a s er e g i o ng e n e sw e r ea m
6、p l i f i e db yP C Ra n dT - Ac l o n e df r o mP gA T C C 3 3 2 7 7s t r a i n T h en u c l e o t i d e so ft h et a r g e tD N A f r a g m e n t sw e r e f i r s t l ys e q u e l l c q N 3 1a n dt h e n i n s e r t e di n t ot h ep l e F 4 2 at oc o n s t r u c te x p r e s s i o nV e C - t o m T
7、 h ee x p r e s s i o n so fr g p Aa n dr g p Bp m t e i n l s er e g i o np r o t e i n sw e r ei n d u c e db yI P T Uw i t hd i f f e r e n td o s a g e si nB 1 2 1 D E 3E c o i l R m t d t s T h eh o m o l o g yo fn n c l e o f i d e ss e q u e n c eo ft h ec l o n e dr g p Aa n dr g p Bp m t e
8、i n a s er e g i o ng e n ef r a g m e n t sf r o mA T C C3 3 2 7 7s t r a i n sw e l t 9 8 9 a n d9 9 0 c o m p a r 羽w i t ht h er e p o r t e ds e c l l 1 e l l c e s T h eh o m o l o g yo ft h ea m i n oa c i d 叩n c e so ft h ec l o n e dr g p Aa n dr g p Bp m t e i n a s er e g i o n g e n ef r
9、a g m e n t sW e l t , 9 9 2 a n d9 9 1 ,c o m p a * 1w i t ht h er e p o r t e ds e q u e n c e T h ee x p r e s s i o no u t p u to fR g p Aa n dR g p Bp r o t e i n a s er e g i o n p r o t e i ni np E T4 2 a r g p A r g p B B L 2 1 D E 3s y s t e mw a sa p p r o x i m a t e l y6 0 0 ft h et o t
10、a lb a c t e r i a lp r o t e i n s C o t K i u s f i m A ne x p r e s s i o ns y s t e mo fP sr g p Aa n dr g p Bp m t e i n a s er e g i o ng e n e sw i t hh i # e f f i c i e n c yw a q , s u c c e s s f u l l ye s t a b l i s h e d T h i sw i l lb et h ep r e m i s ef o rt h es t u d yo n t h e
11、i ri m m u n o g e n i c i t ya n db i o l o g i c a lf u n c t i o n s K e yw o r d s :P o r p h ) r o m o n a sg 打删括;r g p A ;r g p B ;g i n g i p a i n S t o m a t o l o g y ,2 0 0 8 ,2 8 ( 7 ) :3 4 0 3 4 2 ,3 4 6 牙龈卟啉菌( P o r p h y r o m o n a sg i n g i v a l i s ,段) 作为 革兰氏阴性、专性厌氧的产黑色素杆菌,是目前公认
12、的牙周炎最重要的病原菌。牙龈素( g i n g i p a i n s ) 存 在于珞外膜、膜泡或胞外,与牙周疾病密切相关, 它包括精氨酸一牙龈素( a r g i n i n e g i n g i p a i n s ,R g p s ) 和赖氨酸一牙龈素( 1 y s i n e g i n g i p a i n ,K g o ) 。分子研 究发现R S p s 由r g p A 和r g p B 两个基因编码组成幢J 。 r g p A 、r g p B 存在于P g 染色体基因组D N A 中,r g p A 基 因的D N A 序列由前肽区、蛋白酶区和粘附区组成, r g p
13、B 基因的前肽区,蛋白酶区与r g p A 相应区段紧密 相关,但无粘附区。本研究用聚合酶链式反应( p o l y 基金项目:国家自然科学基金资助项目( 3 0 4 7 1 8 8 8 ) 作者单位:1 浙江大学医学院附属第二医院口腔科,杭州( 3 1 0 0 0 9 ) ;2 浙江大学医学院病原微生物学教研室,杭州( 3 1 0 0 5 8 ) 通信作者:陈莉呵T e l :( 0 5 7 1 ) 8 7 7 8 4 5 7 6 E - m a i l :y a n c h e n m a i l h z z j c l I m e r a s ec h a i nr e a c t i
14、o n ,P C R ) 方法从P g 菌株A T C C 3 3 2 7 7 中扩增r g p A 、r g p B 蛋白酶区基因,经T A 克 隆后测序,构建p E T4 2 a r g p A r g p B E c o l i B 1 2 1D E 3 高效表达系统。 1 材料与方法 1 1 菌株来源和培养 艮A T C C3 3 2 7 7 株由浙江大学医学院病原生物 学教研室保存和提供。培养基为含体积分数为8 的( V V ) 冻融脱纤维羊血、ln w L 维生素K l 、5m # L 氯化血红素的牛心脑( B i l l ) 琼脂平板。在B H I 琼脂 平板上接种殿后,置厌氧培
15、养箱内,在1 0 H 2 、 1 0 C 0 2 和8 0 N ,气体环境中3 7 培养7d 。挑取 产黑色素的菌落增菌后按常规进行P g 的鉴定。 1 2 D N A 的制备 采用常规的苯酚一氯仿法提取P gA T C C3 3 2 7 7 万方数据 旦壁蜃堂垄嗵生Z 旦l 箜垫鲞蔓Z 塑2 坠婴堂虹:! 型:垫:2 :丛:2 坚 株的D N A ,经无D N A 酶的R N A 酶消化后,再次用苯 酚一氯仿法提取的D N A 溶于r I E 缓冲液中,用分光 光度法测定D N A 的浓度和纯度。 1 3P C R 扩增 根据P gA T C C3 3 2 7 7r g p A 和r g p
16、 B 基因核苷酸 序列( G e n B a n kN o :A E 0 1 5 9 2 4 、嗍1 ) 和表达载体克 隆位点内切酶图谱分析结果,选择内切酶:N d eI 、 X h oI ,设计引物序列:r g p A 上游引物57 一G C GC A T A 堕C G TT A CA C AC C GG T AG A G 一3 ,下划线处为 酶切位点;下游引物5 一G C GC T CG A GG C GA A G A A G l T CG G GG G CA T C 一3 ,下划线处为酶切位 点。r g p B 上游引物5 7 一G C GC A TA T G r A TA C G C
17、C TG T TG A AG A AA A GG A G 一37 ,下划线处为酶切 位点;下游引物5 一G C GC T CG A GA G AT G TA C C 眦C A C 哪c A CA T C 一37 ,下划线处为酶切位点。 采用P C R 扩增r g p A 、r g p B 蛋白酶区基因片段,2 5 0 n m o l L 各引物,0 0 2 5U LE x T a q 酶( T a K a R a ) 、1 0 0 n gD N A 模板、0 2m m o l Ld N T P 混合物、1 0 倍P C R 缓冲液,反应总体积1 0 0 脚。P C R 参数:9 4 5m i
18、n 1 ;9 4o c1m i n ,5 0 3 0s ,7 2 2 m i n 2 0 ;7 2 7 m i nxl 。引物由上海英骏生物技术有限公司( h v t r o g e n ) 合成。1 5 的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产 物。 1 4T A 克隆和亚克隆 采用T A 克隆将扩增的目的片段克隆至p U C m T 载体( 上海博彩生物科技有限公司) 中,转化于 E c o i lD H 5 a 并扩增,碱变性法提取质粒,委托英骏公 司测序。获得满意的测序结果后,分别扩增含p U C m T r g p A 、r g p B 蛋白酶区基因和p E T 4 2 a 的E c o l i
19、D H S a ,提取质粒后用N d eI 和X h oI 双酶切获得目的 基因片段与线状p E T 4 2 a ,采用大连宝生物有限公司 ( T a K a R a ) 试剂盒连接后转化于E 耐iB L 2 l D E 3 ,构建 目的基因原核表达系统p E T 4 2 a E e o l iB L 2 1 D E 3 ,扩 增、提取重组表达载体p E T 4 2 a 后再次测序。 1 5 核苷酸序列测定 委托上海英骏生物技术有限公司测定p U C m T 和p E T 4 2 a 重组质粒中插入片段的核苷酸序列,并 与报道的r g p A 、r g p B 蛋白酶区基因核苷酸序列进行 比较
20、。 l 。6 重组蛋白表达和鉴定 r g p A 、r g p B 蛋白酶区基因重组表达系统p E T 4 2 a E e o l iB L 2 1 D E 3 分别在含0 5 、1 0m m o l LI P T G 的L B 培养基中震荡培养,诱导温度为3 7 ,采用 1 0 S D S P A G E 检测并估计及其表达量。 2 结果 3 4 l 2 1P C R 从P sA T C C3 3 2 7 7 模板中扩增获得预期大小的 目的条带( 图1 ) 。 A :r g p A ;B :r g p B 1 :D N A 标记;2 ,3 ,4 :自P gA T C C3 3 2 7 7D
21、N A 模板中扩增获得 的r s p A ( B ) 蛋白酶区摹因片段 1 :D N Am a r k e r ;2 ,3a n d4 :t h et a r g e tr g p Bp r o t e i n a s em g i o ng e m f 娜m e n t sa m p l i f i e df r o mD N At e m p l a t e so f A T G C3 3 2 7 7 图I 陬A T C C3 3 2 7 7 株中扩增的r g p A 、 r g p B 蛋白酶区基因目的条带 隐1r g p Aa n dr g p Bp r o t e i n a s e
22、r e g i o ng e n e f h I 萨瑚临a m p l i f i e df r o mP gs t r a i n sA T C C3 3 2 7 7 2 2 核苷酸序列分析 P gA T C C3 3 2 7 7 株r g p A r g p B 蛋白酶区基因的 核苷酸序列、p U C m T 与p E T 4 2 a 重组质粒中插入 的r g p A r g p B 蛋白酶区基因片段核苷酸序列完全相 同,与已报道的r g p A r g p B 蛋白酶区基因序列比 较【3 - 4 】,核苷酸序列同源性分别为9 8 9 、9 9 0 , 氨基酸序列同源性分别高达9 9 2
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