氰化钠急性染毒对大鼠大脑皮层损伤的作用机制.pdf
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1、收稿日期:2005 - 05 - 04;修回日期:2005 - 07 - 04 作者简介:吴波拉(1976) ,女,讲师,硕士研究生,研究方 向:神经药理学,药理毒理学。 氰化钠急性染毒对大鼠大脑皮层损伤的作用机制 吴波拉,陈醒言,朱桐君,林丹,虞希冲 (温州医学院茶山校区药学院药理教研室,浙江 温州325035) 摘要:目的研究氰化钠(NaCN)急性染毒对大鼠大脑皮层及皮层线粒体损伤作用及其机制。方法腹腔注射 NaCN 亚致死剂量(3.2 mg/ kg)染毒 5、15、30、60、90 min 后采用比色法测定大鼠大脑皮层和皮层线粒体相关氧化和 抗氧化酶系活性;用透射电镜观察各时相点染毒大鼠
2、脑组织超微结构变化;按 Veitch 和 Dunkley 等方法测定不同浓度 氰化钠体外孵育大鼠大脑皮层线粒体呼吸链复合酶的活性。结果 (1)NaCN 染毒 5 min 后大脑皮层和皮层线粒体过氧 化物歧化酶(SOD) 、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px) 、钠钾腺苷三磷酸酶(Na+-K+-ATPase) 、钙镁腺苷 三 磷 酸 酶 (Ca2 +-Mg2 +-ATPase)的活性明显下降,黄嘌呤氧化酶(XOD)活性明显增高,以皮层线粒体各指标改变最为显著(均 P 0.001) 。 (2)染毒大鼠神经细胞严重受损,神经元、神经胶质细胞、线粒体等出现严重水肿、空泡化伴有溶解现 象。 (3)经 Na
3、CN 损伤后,离体皮层线粒体呼吸链复合酶的活性显著下降(P 0.001) ,同时引发复合酶活性的剧 增(P 0.001)和复合酶活性的下降(P 0.01) 。结论NaCN 急性中毒可导致大脑皮层及皮层线粒体氧化-抗氧化 系统平衡失调,抗氧化能力下降,自由基生成增多,ATPase 活性下降,并增加了线粒体呼吸链的电子漏,提示皮层线 粒体损伤在氰化物中枢毒作用中可能起重要作用。 关键词:氰化钠;大鼠;大脑皮层;线粒体;氧化;抗氧化 中图分类号: O623.76; R338文献标识码: A 文章编号: 1002 - 221X (2006) 02 - 0074 - 04 Acute toxic eff
4、ect of sodium cyanide on cerebral cortex of rats and its mechanism WU Bo-la,CHEN Xing-yan,ZHU Tong-jun,LIN Dan,YU Xi-chong (Department of Pharmacology,Wenzhou Medical College,Wenzhou 325035,China) Abstract:Objective To study the injury effect and its mechanism of sodium cyanide(NaCN)by acute exposur
5、e on cerebral cor- tex,especially on the mitochondria of cerebral cortex cells in rats. Method According to study design,5、15、30、60 and 90min after injection i.p with sub-deadly dose(3.2mg/ kg)of NaCN,the interrelated indices of oxidative-antioxidative system in cerebral cor- tex and the mitochondri
6、a of the cortex in rats were measured by colorimetric techniques. Meanwhile,the ultrastructural changes of cere- bral cortex of the rats were examined by electron transmission microscopy. Additionally,the activities of the respiratory enzymes in mito- chondria of cerebral cortex cells cultured with
7、different concentrations of NaCN in vitro were also measured by Veitch and Dunkleys method. Result(1)In NaCN group,the activities of SOD,GPX,Na+-K+-ATPase,Ca2 +-Mg2 +-ATPase in the cortex and in the mito- chondria were all decreased distinctly compared with the controls even 5min after injection of
8、NaCN,while the activity of XOD showed definite increase in mitochondria seemed more significant(P 0. 001) .(2)The damages in cortex of NaCN exposed rats showed more severe;edema,vacuolation and lysis could be seen clearly in neurons,neuroglial cells,especially their mitochondria by the electron tran
9、smission microscopy.(3)The activities of complexand II in respiratory chain of cortex exposed to NaCN in vitro was obviously decreased(P 0.001) ,while the activity of complexin the respiratory chain was increased dramatically( P 0.001) . Conclu- sion NaCN has the effect that may lead to dysequilibri
10、um of oxidation/ antioxidation of cerebral cortex,especially the mitochondria,de- cline of the antioxidative ability,increase of the production of free radicals,decrease of activity of ATPase,and increase of electron- leaking in respiratory chain of mitochondria,which suggested that the injury in mi
11、tochondria of cerebral cortex might play an important role in cyanide-induced neurotoxicity. Key words:Sodium cyanide;Rat;Cerebral cortex;Mitochondria;Oxidation;Antioxidation 氰化钠是一种快速杀伤毒物,属高毒类。一般认 为氰化钠毒作用是其解离出的氰根(CN - )对线粒体 呼吸链的终末酶-细胞色素氧化酶 aa3的抑制,使细胞 生物氧化过程受阻,中枢神经系统是其主要的靶器 官。Pettersen 发现致死量和非致死量氰化物中
12、毒,对 脑细胞色素氧化酶活性的抑制无显著差异。急性氰化 物中毒时,毒剂的吸收量往往大于选择性抑制细胞色 素氧化酶活性所需的最小量,提示氰化物中毒还可能 影响其他酶和生物系统活性 1。为此,我们对氰化物 中枢毒作用作进一步的研究,以期为开发新的抗氰药 物提供毒理学依据。 47中国工业医学杂志2006 年 4 月第 19 卷第 2 期Chinese J Ind MedApr 2006,Vol. 19 No. 2 1材料与方法 1.1主要试剂和仪器 氰化钠(NaCN) ,上海化学试剂采购供应站提 供,分 析 纯;SOD 测 试 盒、 GSH-Px 活 力 试 剂 盒、 XOD 测定试剂盒、ATP 酶
13、测定试剂盒,均由南京建成 生物工程研究所提供。722 分光光度计(上海分析仪 器二厂) ,PolarStar/ Fluostar 高 通 量 药 物 筛 选 多 用 仪 (德 国 产) , CR-21G 高 速 冷 冻 离 心 机 (HITACHI) , CR22E 高速冷冻离心机(HITACHI) ,台式高速冷冻 离心机 TGLL-18G(上海安亭科学仪器厂) ,透射电镜 (HITACHI-600) 。 1.2实验动物 SD 大鼠,由温州医学院实验动物中心和中国医 学科学院协和医科大学药物研究所动物中心提供,体 重(200 20 ) g, 雌雄各半。实验前动物禁食 12 h,饮 水不限。 1
14、.3大脑皮层、皮层线粒体 SOD、GSH-Px、XOD、 ATPase 的测定 SD 大鼠 36 只,随机分成 6 组,每组 6 只,生理 盐水(NS)组腹腔注射 NS 10 ml/ kg,30 min 后断头 处死;其余各组注射 NaCN 3.2 mg/ kg(亚致死剂量) , 分别于染毒后 5、15、30、60、90 min 断头,在冰浴 中迅速分离大脑皮层。 1.3.1取大脑皮层冰浴中制成10% 匀浆,3 000 r/ min 离心 4 min,取上清液测定 SOD、GSH-Px、XOD、 Ga2 +-Mg2 +-ATPase、Na + -K + -ATPase 的活性。 1.3.2取大
15、脑皮层按文献2方法略改,提取皮层 线粒体, - 20 分装保存。临用前将分离纯化的线 粒体于 20 / - 20 反复冻融 3 次,用 Lowry 法测定 蛋白 含 量, 测 定 线 粒 体 内 SOD、 GSH-Px、 XOD、 Ca2 +-Mg2 +-ATPase、Na + -K + -ATPase 的活性。 1.4脑组织超微结构透射电镜观察 SD 大鼠 3.2 mg/ kg 染毒后不同时间,取大鼠大脑 皮层常规电镜制样,作超微结构观察。 1.5离体大鼠大脑皮层线粒体呼吸链复合酶 活性测定 SD 大鼠 8 只断头,取大脑皮层组织,制备线粒 体。最后将沉淀悬于 SET 缓冲液中,以 Lowe
16、y 法测定 蛋白含量,调整蛋白浓度约 1 mg/ ml,4 保存备用。 用 PBS 缓冲液配制不同浓度的 NaCN 组,即 PBS 组、 0.1 mmol/ L 组,1 mmol/ L 组,按 Veitch 和 Dunkley 等 方法测定体外孵育大鼠皮层线粒体呼吸链复合酶 活性 3, 4。 1.6统计 实验数据按 SPSS10.0 统计软件处理。 2结果 2.1NaCN 染毒对大鼠大脑皮层组织、线粒体 SOD、 GSH-Px、 XOD、 Ca2 +-Mg2 +-ATPase、 Na + -K + -ATPase 的影响(见表 1,2) 表 1 NaCN 染毒对大鼠大脑皮层组织各酶活性的影响(
17、n = 6,x s) 测定指标NS 组 NaCN 染毒组 5min15 min30 min60 min90 min SOD(U/ mg pro) 487.3 30.59424.6 35.6*399.2 22.5*405.4 20.6*409.5 30.2*413.0 14.4* GSH-Px(U) 6.03 0.135.94 0.154.83 0.35*5.11 0.18*5.34 0.19*5.40 0.13* XOD(U/ g) 20.64 0.8720.46 1.2728.37 1.81*28.48 1.78*27.82 0.54*26.99 1.22* Ca2 +-Mg2 +-ATPa
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