沉默人p38MAPK基因表达的RNA干扰的逆转录病毒载体的构建.pdf
《沉默人p38MAPK基因表达的RNA干扰的逆转录病毒载体的构建.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《沉默人p38MAPK基因表达的RNA干扰的逆转录病毒载体的构建.pdf(3页珍藏版)》请在三一文库上搜索。
1、现代中西医结合杂志M o d e r nJ o u r n a lo fI n t e g r a t e dT r a d i t i o n a lC l i r 螂ea n dW e s t e r nM e d i c i n e2 0 0 8O c t 。1 7 ( 3 0 )4 6 6 7 簸霞鬻 沉默人p 3 8 M A P K 基因表达的R N A 干扰的逆转录 病毒载体的构建 朱美华1 ,温红艳1 ,唐普润1 ,梁敏1 ,刘启才2 ( 1 广州医学院第二附属医院,广东广州5 1 0 2 6 0 ;2 广州医学院实验医学研究中心,广东广州5 1 0 1 8 2 ) 摘要】目的
2、构建沉默人p 3 8 M A P K 基因表达的R N A 干扰的逆转录病毒表达栽体。方 法查找人p 3 8 M A P Kc D N A 序列,利用软件设计并合成能够形成互补双链并能转录出靶向人 p 3 8 M A P K 基因的短发夹状R N A 的两条寡核苷酸序列,退火后连接至线性化载体p S I R E N 上, 获得重组质粒p S I R E N p 3 8 M A P K ,酶切和测序进行鉴定。饽秉双酶切重组质粒获得特定的 酶切图谱,证实所合成核酸片段的正确重组;测序结果显示重组核酸片段序列与设计的序列完 全相同。肇论成功构建了沉默人p 3 8 M A P K 基因的重组质粒p S
3、 I R E N p 3 8 M A P K 。 【关键词】R N A 干扰;p 3 8 M A P K ;逆转录病毒表达栽体 中图分类号】R 一3 3 文献标识码 A 文章编号】1 0 0 8 8 8 4 9 2 0 0 8 ) 3 0 4 6 6 7 一0 3 C o n s t r u c t i o no faR N A i n t e r f e r i n gr e t r o v i r u sv e c t o rf o rm a k i n gs i l e n c eo fp 3 8 M A P Kg e n ee x p r e s s i o n Z h uM e i
4、h u a l ,W e l lH o n g y a n l ,T a n gP u r u n I ,L i a n gM i n l ,L i uQ i c a i 2 ( 1 T h eS e c o n dA f f i l i a t e dH o s p i t a lo fG u a n g z h o uM e d i c a lC o l l e g e ,G u a n g z h o u5 1 0 2 6 0 ,G u a n g d o n g ,C h i n a ;2 E x p e r i m e n t a l R e s e a r c hC e n t e
5、 ro fG u a n g z h o uM e d i c a lC o l l e g e ,G u a n g z h o u5 1 0 1 8 2 ,G u a n g d o n g ,C h i n a ) A b s t r a c t :O b j e c t l v eI ti st oa p p r o a c ht h em e t h o do fc o n s t r u c t i n gaR N Ai n t e r f e r i n gr e t r o v i r u av e c t o rf o rm a l d n gs i l e n c e t
6、h ee x p r e s s i o no fp 3 8 M A P Kg e n e M e t h o d sS e a r c hf o rt h es e q u e n c eo fh u m a np 3 8 M A P Kc D N A ,d e s i g na n ds y n t h e s i z ew i t h s o f t w a r et w os h o r th a i r p i n - s h a p ed i g o n u c l e o t i d es e q u e n c et h a tc a nf o r mac o m p l e
7、m e n t a r yd o u b l e - s t r a i na n dt r a n s c r i p tt a r g e t h u m a np 3 8 M A R Kg e n e ,a f t e ra n n e a l i n g ,c o n n e c t i n gt ot h el i n e a rv e c t o ro fp S I R E N ,h a r v e s t i n gar e c o m b i n a n tp l a s m i d p S I R E N p 3 8 M A P K ,i d e n t i f i c a
8、t i o nt h r o u g he n z y m ed i g e s t i o na n ds e q u e n c i n gw a sm a d e R e s u l t sS p e c i f i er e s t r i c t i o ne n z y m e m a pW a so b t a i n e df r o md o u b l ee n z y m ed i g e s t i o n ,v e r i f i e dc o T f e c t n e 8 8o ft h er e c o m b i n a t i o no fs y n t h
9、 e s i z e dn u c l e a t ef r a g m e n t ; s e q u e n c i n gs h o w e di d e n t i t yb e t w e e nt h er e c o m b i n a n tn u c l e a t ef r a g m e n ta n dt h ed e s i g n e ds e q u e n c e C o n c l u s i o nT h er e e o m b i n a n tp l a s m i dp S I R E N p 3 8 M A P Kt h a tC a nm a k
10、 es i l e n c et h eh u m a np 3 8 M A P Kg e n ei ss u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e d K e yw o r d s :R N Ai n t e r f e r i n g ;p 3 8 M A P K ;v e c t o ro fr e t r o v i r u se x p r e s s i o n 支气管哮喘是一种常见的呼吸道疾病,据统计全球约有 1 7 亿哮喘患者,且发病率逐年上升。支气管哮喘以气道 慢性炎症、气道高反应性、气道重塑为特征,其发病涉及到一 个复杂炎症反应的网络
11、系统。目前以糖皮质激素为主的治疗 策略使急性期气道炎症得到缓解,但对于慢性气道重塑的改 善作用很小,且不少患者还存在激素抵抗。因此,防治和改善 气道重塑成为哮喘研究的另一大课题。气道重塑的基础是支 气管平滑肌细胞增生、肥厚,目前研究认为,其主要机制是多 种细胞炎症因子与细胞膜受体结合后,通过改变细胞的信号 传导途径引起平滑肌细胞的增殖。在众多与细胞信号相关的 转导酶中,促分裂原活化蛋白激酶( m i t o g e na c t i v a t e dp r o t e i n k i n a s e ,M A P K ) 中的p 3 8 亚家族是引起哮喘支气管平滑肌细 作者简介】朱美华( 1
12、 9 6 2 一) ,女,儿科主任医师。主要从事儿科 哮喘相关临床与实验研究。 基金项目】广东省医学科研基金项目( A 2 0 0 6 3 0 6 ) 胞增殖的关键酶 引。本课题利用R N A i 技术3 4 j ,通过沉默 p 3 8 M A P K 基因表达,期望从控制气道重塑方面为慢性支气 管哮喘的治疗开辟一条新路。 1 材料与方法 1 1 主要材料p S I R E N R e t r o Qv e c t o r 载体购自美国C l o n t e c h 公司( 经B a m H I 和E c o R I 双酶切并回收) ;T 4D N A 连 接酶、限制性内切酶B g ll I
13、和E c o RI 为N E B 公司产品,D N A m a r k e rD L 2 0 0 0 与D L l 5 0 0 0 为日本T a k a r a 公司产品;质粒小 量提取试剂盒购自德国Q I A g e n 公司。 1 2 方法 1 2 I 制备小发夹状R N A ( S h R N A ) 模板的设计 G e n B a n k 查询p 3 8 M A P K 基因的c D N A 序列,序号为N M - 0 0 1 3 1 5 ,通过 A m b i o n 公司提供的R N A i 设计工具确定5 一C A A G A C A A T a 麟A G 、G 3 为沉默的靶序
14、列。经B l a s t 比较, 该序列与同种属其他基因无同源性。根据载体转录生成 s h R N A 的要求合成两条反向互补的寡核苷酸:分别为正义链 万方数据 4 6 6 8 现代中西医结合杂志M o d e r nJ o u r n a lo fI n t e g r a t e dT r a d i t i o n a lC h i n e s ea n dW e s t e r nM e d i c i n e2 0 0 8O c t 1 7 ( 3 0 ) S ! 一G 虹C C G C A A G 睑C T G G G A G G T 陬C A A G K C A C C T C
15、C C A G A T T G T C T T G T T T T T T G G A A G 一3 和反义链 5 一A A T T C T T C C A AA A A A C A A G A C A A T C T o G G A G G T G T c T C r T G A A C A C C T C C a 地T TT C T T G C G 一3 。正义链5 端加框区为干扰的靶序列,37 端加框区为与之反向互补序 列,中间为l o o p 结构。同时在寡核苷酸两端分别引入限制性 内切酶B a m HI 和E c o RI 酶切位点。提交序列给T a K a R a 公司合成寡核苷酸
16、。 1 2 2 逆转录病毒载体p S I R E N p 3 8 M A P K 的构建首先 将合成的两条寡核苷酸溶于相应体积的灭菌超纯水中,制成 终浓度为2g L 的D N A 溶液。然后取正义链与反义链D N A 溶液各1 肛L ,加入4 8p L 的退火缓冲液( 含1 0 0m Mp o t a s s i u m a c e t a t e ,3 0m MH E P E S K O Hp H7 4 ,2m Mm a g n e s i u ma c e t a t e ) ,充分混匀,9 5 变性3m i n ,3 7 复性ih 。将退火后 的双链寡核苷酸溶液稀释为8m g L 后与载
17、体进行连接。在 连接体系中加入:线性p S I R E N R e t r o Qv e c t o r ( 2 5m g L ) 2 止,退火的双链寡核苷酸( 8m g L ) 2 肛L ,1 0 T 4 连接酶反 应缓冲液2 肛L ,灭菌超纯水1 3p L ,最后加入T 4 连接酶1 肛L , 充分混匀,1 6 反应过夜。连接产物转化感受态大肠杆菌 T G l ,挑选单克隆菌落摇菌过夜,少量提取质粒。 1 2 3 重组质粒p S I R E N p 3 8 M A P K 酶切鉴定和测序按 Q I A g e n 质粒少量提取试剂盒说明书,提取各单克隆菌落中的 质粒,建立2 0 弘L 双酶
18、切体系:质粒p S I R E N p 3 8 M A P K ( O 2 3g L ) 8 止,1 0 3 号缓冲液2 止,B g lI I ( 1 5I U 以L ) I p L ,E c o RI ( 2 0I U 以L ) 1 弘L ,补灭菌超纯水8 弘L ,3 7 水浴4 h 进行酶切反应。酶切产物在1 的琼脂糖凝胶中电泳。凝 胶成像系统观察结果并照相。选择经双酶切鉴定的阳性重组 质粒送T a k a r a 公司进行序列分析。 2 结果 2 1 重组质粒p S I R E N p 3 8 M A P K 的酶切按照实验设计 的双链寡核苷酸模板的5 端和3 端被分别引入了B a m
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 沉默 p38MAPK 基因 表达 RNA 干扰 逆转录 病毒 载体 构建
链接地址:https://www.31doc.com/p-3714753.html