小鼠胰岛素样生长因子结合蛋白7原核表达载体的构建.pdf
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1、收稿日期: !“! # “$ # $% 作者简介: 邱惠 ($ 片段, 测序正确后, 克隆于融合表达载体 24 中构建原核表达重组体。 关键词: 胰岛素样生长因子结合蛋白 ; 123041; 56783041 中图分类号: 1# +!文献标识码: ; 文章编号: $“$ # * 首次是从人的正常衰老的乳腺上皮细胞中克隆出 来的 + 。它的生物学作用尚未完全阐明。目前的 研究表明, ,-./0 除了具有调节 ,-. 的功能外, 还是一种重要的生长抑制因子, 参与细胞衰老与 凋亡等多种生理过程 *, ? 。本研究工作中, 利用 123041 及 56783041 技术 (从小鼠的脾脏中扩增 得到编
2、码 E,-./0 的 :5; 片段, 经纯化, 测序鉴 定后, 运用酶切、 连接等重组手段, 将其定向插入 带有 ( 个 FG7 序列的原核表达载体 24 中, 构 建成 23E,-./0 融合表达重组体, 从而为今 后进一步研究其功能打下基础。 $材料与方法 !“!试验材料 ($) 动物: /;H/I4 小鼠, ( 周龄, 每只重 $?D, 购于湖北省防疫站。 (!)质粒与菌种: 01=24 质粒 (为含 2 启动 子的融合表达载体, 插入目的基因后, 表达的蛋白 质 5 端融合 ( 个 FG7) , :F?3#, 为华中科技大学同 济医学院实验中心保存并提供。 (+)工具酶与试剂: 限制性
3、内切酶、 2* 连接 酶、 总 15; 提取试剂盒购自 -,/4J 公司,:5; KLCM6C 及 123041 试剂盒购自 0CE6DL 公司, 2LN:3 5; 聚合酶购自华美公司。 (*)引物: 根据小鼠 ,-./0 9:5; 序列设计: !$为 内 侧?O引物, 序列为?O3 2;2;-;224224424224-;2-442-43+O ; ! 为内侧 +O引物, 序列为 ?O3-2-;4;-4222;-43 2;4;-;-424;2-3+O; !+ 为外侧 ?O引物, 序列 为: ?O3424244242244244242243+ O; !* 为外侧 +O 引物, 序列为 ?O3-;
4、-2-2-24;-4;-;-43+O。 其中 !$, ! 两条引物分别含有 91!和 FGPQ$ 酶切位点。以上四条引物均由上海博亚生物技术 公司合成。 !)#试验方法 ($) 总 15; 的提取: 解剖小鼠, 取其新鲜脾脏 ?“ED, 加入 $EH 2CGRA 匀浆, 按照 -,/4J 公司总 15; 提取试剂盒的说明操作, 提取出 15; 后, 溶 于 :04 水中, 于 # “S保存备用。 (!)123041 扩增目的基因: 以提取的总 15; 为模板, 加入引物 !+, !* 各 ?“#双酶切, 用酚冻法回收 片段, 再用 5$ 连接酶连接构成重组体, 然后转化 ?=!6$, 挑取阳性
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