山茶花总黄酮对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用.pdf
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1、中国药 理学通报 C h i n e s e P h a n n a c o l o g ic a l B u l l e t i n 2 0 0 6 N o v ; 2 2 ( 1 1 ) : 1 3 8 3 - 6 1 3 8 3 山茶花总黄酮对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用 罗胜勇, 董六一, 范丽, 方明, 陈志武 ( 安徽省医学 研究所, 安徽合肥 2 3 0 0 6 1 ) 中国图书分类号: R - 3 3 2 ; R 2 8 2 . 7 1 ; R 2 8 4 . 1 ; R 3 2 9 . 2 4 ; R 3 4 5 . 4 9; R 7 4 1 . 0 4 4; R 7 4
2、3 . 3 1 0 . 5 3 ; R 9 7 7 . 3 文献标识码: A 文章编号: 1 0 0 1 - 1 9 7 8 ( 2 0 0 6 ) 1 1 一 1 3 8 3 一 。 摘要: 目的 研究山茶花总黄酮( T F C ) 对大鼠全脑缺血再灌 注损伤的 保护作用。方法 按p u l s i n e l l i 方法制成全脑缺血 模型, 大鼠全脑缺血3 0 m i n 后再灌注4 0 m i n 。记录脑缺血一 前、 缺血3 0 m i n 及再灌注4 0 m i n 后的脑电图( E E G ) , 取脑组 织, 采用荧光指示剂F u r a - 2 定量测定大鼠 前脑皮层组织细胞
3、 钩游 离 钙离 子 浓 度, 测 定超 氧 化 物 歧 化酶( S O D ) 、 谷胧 甘肤 过氧化物酶( G S H - P x ) 、 乳酸脱氢酶( L D H ) 、 一氧化氮合酶 ( N O S ) 活性和丙二醛( M D A ) 、 一氧化氮( N O ) 含量。结果 T F C 可促进缺血后 E E G波幅的恢复, 降低缺血再灌后细胞 内 游离钙离子浓度的升高, 抑制S O D , G S H - P x 和L D N活力 的下降, 降低N O S 的活力和脑组织中M D A , N O的含量。结 论 T F C 对脑缺血再灌注损伤有保护作用, 其机制可能与其 抗自由基、 抑制
4、钙超载和N O生成有关。 关键词: T F C ; 脑缺血再灌; 脑电图; 丙二醛; 一氧化氮; 游离 钙离子 近年来, 多种黄酮类化合物经研究证实对脑缺 血 损 伤 具 有 保 护 作用 。 山 茶 花 总 黄 酮( t o t a l o f fl a - c o n e C , T F C ) 是从山茶花种提取的有效部位, 前期 研究表明 其对心肌缺血损伤有保护作用 2 , 但对于 收稿日 期: 2 0 0 6 - 0 7 - 2 3 , 修回日 期: 2 0 0 6 - 0 9 - 1 0 基金项目: 安徽省自 然科学基金资助项目 ( N o 9 9 0 4 4 4 3 3 ) 作者简
5、介: 罗胜勇( 1 9 7 9 一) , 男, 硕士生, 研究方向: 心脑血管药理 E - m a i l : 1 s y 7 7 0 7 2 8 7 1 2 6 . c o m; 陈志武( 1 9 6 5 一 ) , 男, 博士生导师, 研究方向: 心脑血管药 理 脑缺血损伤的研究还未见报道。 本实验在大鼠急性 全脑缺血再灌注模型上观察T F C 对脑缺血损伤的 保护作用, 并初步探讨其作用机制。 1 材料与方法 1 . 1 动物W i s t e r 大鼠, 1 2 0只, ?a 各半, 体重 ( 2 5 0 t 5 0 ) g , 由 安徽医科大学实验动物中心提供, 合格证: 皖医实动准
6、字0 1 号 1 . 2 仪器 B L -4 2 0 E 生物机能实验系统: 成都泰盟 科技有限公司; T D Z 4 - W S 低速台式离心机: 长沙湘 仪离心机仪器有限公司; 内切式组织匀浆机: 浙江机 械厂; 电热水浴锅: 上海医疗器械三厂; 上平牌电子 天平: 上海分析仪器厂; 6 5 0一 6 0荧光分光光度计: 日 本H I T A C H I 公司; 7 5 6 - 紫外分光光度计: 上海精 密仪器有限公司; 倒置显微镜: 重庆光学仪器厂; 计 数器及白细胞计数板、 2 0 0目 滤网。 1 . 3 试剂T F C由安徽医科大学天然药物研究所 提供, 黄色粉末, 用前用生理盐水
7、溶解至所需浓度; 银杏叶提取物( E G B ) , 由宁波市中药厂提供, 批号: 2 0 0 1 0 0 0 ; P B S 缓冲液: 本室自制; D M E M液体培养 基: G m b H产品, 批号: E 0 2 8 2 3 -5 8 6 ; 1 0 %胎牛血清 ( F B S ) : 四季清公司, 批号: A 7 9 0 4 ; 胰酶: A m r e s c o 公 司; F u r a - 2 / A M, ; S i g m a 公司; 二甲基亚矾( D M S O ) ; 中国 上海金山化工厂, 批号: 9 3 0 1 0 5 ; 聚乙二醇辛基 苯基醚( T r i t o
8、n X - 1 0 0 ) ; S i n - A m e r i c a n B io t e c , 批号: 0 3 1 8 0 1 A ; 乙二醇 一双一 ( 2 - 氨基乙基)四乙酸 ( E G T A ) : 南京建成生物工程研究所经销产品, 批 号: 8 8 0 1 0 2 ; M D A试剂盒, 批号: 2 0 0 5 0 6 1 5 ; S O D试剂 盒, 批 号: 2 0 0 5 0 4 0 7 ; G S H - P x试 剂 盒,批 号: L 一 M G - 1 3 2 - t r e a t e d h u m a n h e p a t o c e l l u l
9、a r c a r c i n o m a B E L - 7 4 0 2 c e l l s w e r e c u l t u r e d u n d e r h y p o x i a f o r 6 h o u r s . T h e p r o t e i n e x p r e s s i o n l e v e l o f H I F - l a p r o t e i n i n h u m a n h e p a t o c e l l u l a r c a r c i n o m a B E L - 7 4 0 2 c e l l s w a s c h e c k e
10、d b y W e s t e rn B l o t . R e s u l t s N o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e w a s f o u n d i n t h e c e l l p r o l i f e r a t i o n r a t e a n d c e l l v i a b i l i t y b e t w e e n c o n t r o l a n d d i f f e r e n t c o n c e n t r a - t i o n s o f c u r c u m i n . C u r c
11、 u m i n c a n d o w n - r e g u l a t e t h e e x p r e s s i o n o f H I F - 1 a p r o t e i n w i t h t h e i n c r e a s i n g c o n - c e n t r a t i o n s . t h e e f f e c t o f c u r c u m i n o n e x p r e s s i o n o f H I F - 1 a m R N A h a d n o s i g n i f i c a n t d i ff e r e n c e
12、b e t w e e n c o n t r o l a n d d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s . M G - 1 3 2 c a n r e v e r s e t h e c u r c u mi n - me d i a t e d d e c r e a s e o f HI F - 1 a p r o t e i n . C o n c l u s i o n I n h i b i t o ry e f f e c t o f c u r c u m i n o n e x p r e s s i o n o f H
13、I F - 1 a i n h u m a n h e p a t o c e ll u l a r c a r c i n o - m a B E L - 7 4 0 2 c e l l s w a s a c t e d t h r o u g h p o s t - t r a n s c r i p - t i o n a l m e c h a n i s m s a n d t h e p r o t e a s o m e p a t h w a y . K e y w o r d s : c u r c u m i n; h y p o x i a 一 i n d u c i
14、b l e f a c t o r s - 1 ; h u m a n h e p a t o c e l l u l a r c a r c i n o m a B E L - 7 4 0 2 c e l l 1 3 8 4 中国药理学通报C h i n e s e P h a r m a c o l o g i c a l B u l l e t i n 2 0 0 6 N o v ; 2 2 ( 1 1 ) 凡= 2 2 4 n m o l - L - , 为F u r a 一与C a t + 的解离常数 在计算前减去没有负载F u r a - 2 / A M的细胞中测得 的自 发荧光。
15、 1 . 5 . 2 大鼠另侧脑组织用生理盐水制成匀浆按 试剂盒说明分别测定 S O D , G S H - P x , N O S活性和 M D A , N O含量, 蛋白 质含量用双缩脉法测定。 1 . 6 统计学处理量反应资料以无 士 : 表示, 组间 分析用t 检验, 分级资料用成组设计两样本的秩和 检验。 2 结果 2 . 1 T F C对大鼠全脑缺血再灌注后脑电图变化的 影响 各模型组大鼠脑缺血5 m i n内, 脑电显著受 抑变平。 再灌注过程中, 脑电图波幅有所恢复。再 灌 注4 0 m i n 后, E G B 组, T F C 6 0 , 3 0 m g k g 一 组有
16、明显促进脑电波幅恢复作用, 而对照组的E E G恢复 不明显见T a b 1 , F i g 1 0 Ta b 1E f f e c t o f T F C o n t h e a l t e r a ti o n o f E E G c e r e b r a l i s c h e n d a - r e p e r f u s i o n ( n 二 1 0 ) 加d u c e d b y Do s e /Be f o r e i s c h e m i a - re p e r f u s i o n 4 0 m i n G ro u p. , . 一 丁 一 一 二 二 一 一 篇
17、 厂 一 不 , 一 一 兀 m 吕 k g , 一 1l s c h e n u c 1 u班1 V V S h a m一1 0 1 0 0 0 0 0 ,产4 04 02,乙.1.1 00000 OC000 J.1esll确占立 2 0 0 5 0 6 0 1 ; N O S 试剂盒, 批号2 0 0 5 0 6 1 5 ; N O试剂盒, 批号: 2 0 0 5 0 6 1 5 ; 均购自 南京建成生物工程研究所。 1 . 4 模 型 用四 动 脉 结扎 法 3 制 作大鼠 全脑缺 血 再灌注模型。取 6 0只大鼠, 随机分成假手术组 ( S h a m) , N S 组, E G B组
18、, T F C 3 个剂量组( 6 0 , 3 0 , 1 5 m g k g 一 ) 。 每 组1 0 只, ? a 各 半。 各 组 分 别ig N S 或相应药物, q d , 连续给药3 d 。 末次给药1 h 后, 大 鼠以乙醚麻醉, 分离双测颈总动脉并置丝线待用。 然后, 颈背正中切口, 分离椎旁肌, 暴露第一颈椎翼 状孔, 用电针插人并电凝其下的椎动脉。在烧断椎 动脉前记录正常脑电图( E E G ) , 缝合切口。放回笼 后自由饮水2 4 h 。次日 在大鼠清醒状态下, 应用显 微动脉夹阻断颈总动脉血流, 经5 一 1 0 m i n 待动物 平稳后按V级记录E E G 4 1
19、 , 以E E G波幅下降到原 来的2 5 %以下, 动物翻正反射消失, 自主呼吸存在 为模型成功的标志。 假手术组, 只暴露血管, 不阻断 血流。缺血3 0 m i n 后, 松夹再灌注4 0 m i n o 1 . 5 指标测定 1 . 5 . 1 细胞内钙离子测定 1 . 5 . 1 . 1 细胞悬液制备 5 大鼠 缺血再灌4 0 m i n 后处死, 取一侧大脑皮层组织, ( 另一侧放置一 2 0 c C 冰箱, 3 d 内测其他生化指标) 冰盘上剔除软脑膜及 血管, 用P B S 缓冲液冲洗3 一 4 次, 剪碎后放人 E P 管中, E P 管中 有预温的3 7 的0 . 2 5
20、%胰酶2 m l , 消 化2 0 m i n , 1 5 0 0 r m i n 一 离心5 m i n 后去上清液, 2 m l D M E M培养液( 含1 0 % F B S ) 终止消化, 过2 0 0目 筛。离心去除终止液, P B S 洗 1 次, 最后用D M E M 培养液1 m l 悬浮细胞, 制成细胞悬液, 台盼蓝排斥 实验检查细胞成活率在9 5 %以上。 1 . 5 . 1 . 2 F u r a - 2 / A M负载及荧光测定 上述细 胞悬液3 7 预温5 m i n 后, 加F u r a - 2 / A M 1 0终浓度 为5 u m o l L 一 ) 3 7
21、 恒温振荡4 5 m i n , P B S 洗2 次, 用P B S 1 m l 悬浮细胞。调整细胞数为每m l 含1 0 5 一 1 口个细胞。另外取同一细胞悬液标本1 m l , 不 负载F u r a - 2 / A M作为空白对照管。荧光测定采用 日 本H I T A C H I 6 5 0 - 6 0 荧光分光光度计, 激发波长为 3 4 0 nn , 光栅5 nn , 发射波长为5 1 0 n m , 分别测定 F , F _ x , F m ;n o F为3 4 0 n m激发波长测得的荧光强 度值; F m _ 为最大荧光强度, 即 加人T r i t o n X - 1 0
22、 0 ( 终 浓度为0 . 1 %) 后测得的荧光强度值; F n ,;。 为最小荧 光强度, 即在F ,基础上加人E G T A ( 终浓度为4 . 5 n m o l L 一 ) 后测 得的 荧光 强度 值。 1 . 5 . 1 . 3 C a , 十 i 计算 , C a z + 、 = 凡( F一 F m , ) / ( F ,一 F ) ( 单位: n m o l L 一 ) C o n t m E G B .1 .r .C NS 8 0 m g k g 一 I 6 0 m g k g 一 1 3 0 m g k g 一 1 1 5 m g k g 一 1 3 0 0 0二 0,-
23、3 6 * P 0 . 0 5 , * * P 0 . 0 1 “c o n t ro l g r o u p ; 尸 0 . 0 1 v s s h a m g r o u p . I : E E G b e f o r e t h e i s c h e m i a ( 1 0 0 %) ;II: m i n u t e l y i n h i b i t i o n , p re s s u re a n d f re q u e n c y a re a b o v e 7 5 % a a s b e f o re t h e i s c h e m i a ; m: o b v i
24、- o u s l y i n h i b i t i o n , p r e s s u re a n d f re q u e n c y a re 2 5 %一 7 5 % a s b e f o re t h e i s - c h e m i a ; W: b a d l y i n h i i t i o n , p r e s s u re a n d f re q u e n c y a r e u n d e rs i d e 2 5 % a s b e f o r e t h e i s c h e m i a ; V: i s l e v e l , c e r e b
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