巢蛋白的克隆、表达、抗体制备及免疫组化分析.pdf
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1、收稿日期:2005_09_19 基金项目:国家自然科学基金(30300109,30170300) Supported by National Natural Science Foundation of China(30300109, 30170300) 作者简介:陈新林(1972_),讲师,在读博士研究生,电话:029_82655428, E_mail: 通讯作者:刘 勇,电话:029_82655080,E_mail: 巢蛋白的克隆、表达、抗体制备及免疫组化分析 陈新林 1, 2,刘 勇1, 2,肖新莉1, 2,张 瑾1, 2,吕海侠3,张蓬勃1, 3,刘建新1, 2,赵建军1, 2(西安
2、交通大学医学院1 神经 科学研究中心,2环境与疾病相关基因教育部重点实验室, 陕西 西安710061; 3 第二附属医院, 陕西 西安 710004) 摘要:目的 在原核系统中克隆、表达并纯化巢蛋白(nestin),制备特异性nestin抗体,用于研究nestin在中枢神经系统发 育中的生物学特性,探索神经发育及再生规律。 方法 采用RT_PCR方法由人神经干细胞中获取nestin cDNA,与原核表 达载体pQE30连接,构建重组载体pQE30_nestin。 测序后,将重组质粒转入大肠杆菌M15,IPTG诱导表达His融合蛋 白。 Ni_NTA亲和层析柱纯化后,SDS_PAGE电泳和Wes
3、tern blottinX鉴定。 用此蛋白免疫YAZYc小鼠, 获得抗血清。 Western blottinX、EZISA和免疫组织化学分析鉴定获取的抗血清。 结果 成功由人神经干细胞中克隆nestin cDNA片段。 IPTG诱导重组质粒pQE30_nestin表达出一相对分子质量约25 000的His融合蛋白并被Ni_NTA成功纯化,Western blottinX证明其确为nestin蛋白。 动物免疫后,经Western blottinX、EZISA和免疫组化鉴定,获得的抗血清可特异性结合 重组nestin蛋白、发育期人及大鼠脑内的nestin蛋白。 结论 获得了重组人nestin蛋白,
4、制备的抗血清不仅可识别重组 nestin蛋白,亦可识别人及大鼠脑组织内的nestin蛋白。 关键词:巢蛋白;分子克隆;原核表达;抗体;免疫组织化学 中图分类号:R339.35 文献标识码:A 文章编号:1673_4254(2006)02_0196_05 Cloning, expression, and an ibody prepara ion of nes in wi h immunohis ochemical analysis CHEN in_lin1, 2, ZI onX1, 2, IA_ in_li1, 2, HANG ain1, 2, Z! Hai_xia3, HANG PenX_bo
5、1, 3, ZI aian_xin1, 2, HA_ aian_jun1, 2 1Research Center for Neuroscience, 2bey Zaboratory of Encironment and Genes Related to Diseases of Ministry of Education, Medical School of idan aiaotonX nicersity, iean 710061, Chinaf 3Second Hospital, Medical School of iean aiaotonX nicersity, iean 710004, C
6、hina Abs rac : Objec ive To obtain recombinant nestin and prepare anti_nestin polyclonal antibody gmAb) to explore the bioloXi_ cal roles of nestin in the central nercous system decelopment. Me hods The nestin cDNA has cloned from human neural stem cells by RT_PCR and liXated to proiaryotic expressi
7、on plasmid pQE30 for construction of the recombinant cector pQE30_nestin. After sejuencinX, the recombinant cector has transformed into E.coli M15 and His_taXXed nestin has induced by IPTG. The nestin has purified by Ni_NTA affinity chromatoXraphy column and characteriked by SDS_PAGE and Western blo
8、ttinX. YAZYc mice here immuniked hith the purified recombinant protein to prepare the antiserum, hhich has analyked by Western blottinX, enkyme_linied immunosorbent assay gEZISA) and immunohistochemistry. Resul s The nestin Xene has successfully cloned from human neural stem cells, hhich has identic
9、al to that reported in GenYani. After IPTG induction, the E.coli transformed hith pQE30_nestin plasmid expressed a 25 000 His_taXXed protein, hhich has successfully purified and i_ dentified as nestin by Western blottinX. Western blottinX, EZISA and immunohistochemistry demonstrated that the antiser
10、um could specifically bind to the recombinant nestin as hell as to nestin in fetal human and rat brains. Conclusion We successful_ ly cloned the nestin Xene and expressed the nestin, and nestin mAb prepared can specifically recoXnike not only the recombi_ nant nestin, but also nestin from human and
11、rats brain tissues. Key words: nestinf cloninX, molecularf proiaryotic expressionf antibodyf immunohistochemistry 巢蛋白(nestin)是中间丝的一种,最初被发现特 异表达于神经上皮干细胞中,故亦将其称为神经上皮 干细胞蛋白1。nestin在神经系统细胞的分裂、分化、 迁移和成熟的特定发育过程中表达: 神经胚形成时, 神经板皮层细胞开始表达nestin;神经干细胞的迁移 基本完成后,nestin的表达量逐渐下降; 细胞分化基 本完成,神经系统的各种细胞(神经元、星形胶质细胞 和少突
12、胶质细胞)成熟后,nestin停止表达2。 在中枢 神经系统损伤(如缺血、外伤等)后,随着神经干细胞 活化和神经修复的开始,nestin又开始表达, 主要存 在于室下区、损伤局部的活化神经干细胞和反应性星 形胶质细胞中, 可持续至伤后数十个月 3。 因此, nestin可被用作中枢神经系统中增殖前体细胞的标 志物,以将胚胎和生后发育期细胞与成熟细胞区分开 来。 nestin在中枢神经系统发育中的作用目前还不清 楚。 但已有研究提示,nestin作为细胞骨架成分,可能 南方医科大学学报ga South Med nic) 2006f26g2)196 具有维持神经前体细胞正常形态,在有丝分裂后细胞
13、与靶细胞建立神经联系方面起作用4。 本实验应用基 因工程技术获得重组人nestin蛋白,并通过免疫小鼠 制备特异性抗人nestin抗体, 将有助于进一步研究 nestin生物学特性和在中枢神经系统发育中的作用。 1 材料和方法 1.1 菌株、质粒及实验动物 大肠杆菌DH5!、M15和质粒pQE30由中国疾 病预防控制中心病毒病防治所赠送。BALB/c小鼠购 自西安交通大学实验动物中心。 1.2 试剂 核酸内切酶BamH I、Hind“、taqDNA聚合酶 及T4DNA连接酶均购自TaKaRa公司。Ni_NTA为 Qiagen公司产品, 胶回收试剂盒购自上海生物工程 公司, 反转录试剂盒和弗氏佐
14、剂购自Gibco公司, nestin单克隆抗体购自Santa Crutz公司,BCA蛋白 浓度测定试剂盒购自上海碧云天公司。PCR引物合 成、测序由上海博亚公司完成,其他试剂均为进口或 国产分析纯产品。 1.3 人神经干细胞总RNA的提取和cDNA的合成 收集培养的人神经干细胞,采用TRIZOL一步法 提取总RNA。 按照反转录试剂盒说明书操作合成 cDNA第一链。 1.4 人nestin cDNA片断的扩增 依据Dahlstrand等5报道的序列,选择人nestin cDNA序列3端的450 bp片断,设计引物如下,上游 序 列 :5CGGGATCCATGCCCTGGGATGACAGCTT
15、G3,引入酶切位点BamH I;下游序列:5AAGCTTC TAGGACCAGGACTCTCTATC3, 引 入 酶 切 位 点 Hind III和终止密码。以人神经干细胞cDNA为模板。 PCR循环条件为:94 变性1 min,55 退火1 min, 72 延伸1 min,35个循环后,72 延伸 5 min。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,回收。 1.5 pQE30_nestin450表达载体的构建与鉴定 PCR回收片断经BamH I和Hind III双酶切,与 经同一双酶切的pQE30表达载体连接,构建pQE30_ nestin重组载体。 重组载体转化大肠杆菌DH5!感受 态细胞,
16、挑选阳性菌落,酶切鉴定正确的重组质粒送 测序。 1.6 nestin蛋白片断的诱导表达与鉴定 经鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌M15感受 态细胞,挑取单菌落,IPTG(1 mmol/L)小量诱导,SDS_ PAGE电泳,用商品化nestin进行Western blotting分 析表达产物。 确定诱导表达的蛋白为nestin后,大量诱 导表达。 1.7 重组蛋白的纯化 大量诱导重组nestin表达, 收获诱导后的M15 菌,超声裂菌,离心,分别取超声后上清和沉淀进行 SDS_PAGE。 分析结果表明诱导的蛋白主要存在于沉 淀(包涵体)中,遂采取变性方式进行重组蛋白纯化。 过程简述如下:6 mo
17、l/L盐酸胍变性溶解包涵体,离心 收获上清, 与Ni_NTA蛋白纯化柱结合, 分别用pH 8.0、6.3、5.9的8 mol/L尿素溶液洗涤纯化柱,pH 4.5 的8 mol/L尿素溶液洗脱, 收集洗脱液,SDS_PAGE 电泳鉴定。 1.8 BCA法蛋白浓度测定 透析使蛋白溶液的尿素含量降至4 mol/L, 按试 剂盒说明书操作,测定蛋白浓度。 1.9 动物免疫与抗血清的获取 采用BALB/c小鼠, 下腹部皮下多点注射免疫, 第1次每只动物注射50 #g抗原,用等体积弗氏完全 佐剂乳化;第2、3次每只动物注射100 #g抗原,用等 体积弗氏不完全佐剂乳化;第4次直接注射蛋白溶液 (100 #
18、g/只)。 每次免疫间隔10 d。 第4次免疫前,小 鼠尾部采血,ELISA方法测定免疫效果。 第4次免疫 后10 d,摘除眼球,放血,分离血清,-20 保存备用。 1.10 小鼠抗人nestin多克隆抗体的鉴定 1.10.1 ELISA方法测定抗体效价 按0.8 #g/孔用重 组nestin蛋白包被酶标板,倍比稀释的自制抗体作为 第一抗体, 同样稀释度的正常小鼠血清为阴性对照。 常规双抗体夹心法测定步骤操作, 酶标仪测定波长 450 nm 处D($)值,用EXCEL软件作图并计算各种 稀释度下的P/N值(抗血清D450d空白孔D450/正常血 清D450e空白孔D450), 以P/N值大于2
19、.1者为阳性, P/N值最接近2.1的抗血清稀释度为该抗体效价。 1.10.2 Western blotting 分别取诱导表达后菌液和纯 化蛋白各100 #l,加入等体积 2 蛋白上样缓冲液,沸 水煮10 min后,进行SDS_PAGE电泳;电泳结束后, 将蛋白电转移至硝酸纤维素薄膜上; 丽春红染色后, 圆珠笔标记蛋白质分子量标准位置;用稀释的抗血清 为第一抗体进行免疫学染色。分别用正常小鼠血清和 PBS代替第一抗体作为阴性对照和空白对照。 1.10.3 免疫组织化学染色 取12周人胎儿、 新生1 d SD大鼠、 永久性局灶性脑缺血7 d SD大鼠的脑组 织,常规石蜡及冰冻切片。 用我们制备
20、的抗血清为第 一抗体进行免疫组化染色,阳性对照采用商品化抗体 为第一抗体。 显微镜下观察并取图。 2 结果 2.1 nestin cDNA片段克隆和pQE30_nestin重组质粒 的构建 陈新林f等.巢蛋白的克隆_表达、抗体制备及免疫组化分析第2期197 图2 SDS-PAGE鉴定n+,-.n的表达及纯化 Fig.2 SDS-PAGE analysis of the expression and purifi ation of nestin /0 P12-+.n 3415+16 74n+ 80 9:E; ?+21+ .nABC-.2n6 74n+ 20 9:E; .nABC+A ?D EPF
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