清醒状态下电刺激大鼠上矢状窦模型后脑内FOS阳性神经元的分布.pdf
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1、2 0 1 0 年2 月 中国比较医学杂志 F e b r u a r y ,2 0 1 0 第2 0 卷第2 期C H I N E S EJ O U R N A LO FC O M P A R A T I V EM E D I C I N E V 0 1 2 0N o 2 清醒状态下电刺激大鼠上矢状窦模型 后脑内F o s 阳性神经元的分布 王晓琳,于生元,姜磊,董钊,王晓辉,周志斌 ( 中国人民解放军总医院神经内科,北京 1 0 0 8 5 3 ) 【摘要】 目的清醒状态下电刺激大鼠上矢状窭后免疫组织化学染色观察F o s 阳性神经元在脑内的分布情 况。方法雄性S D 大鼠,手术暴露上矢状
2、窭后电刺激硬脑膜,应用免疫组织化学染色技术观察F o s 阳性神经元在 脑内的分布并绘图。结果电刺激后F o s 阳性神经元在脑内分布广泛,主要集中在高颈段脊髓后角,三叉脊束核 尾侧亚核,中缝核簇,中脑导水管周围灰质脚问核及下丘脑等区域。结论脑内的多个区域参与了偏头痛的发生 和发展过程,除与疼痛的信息传递和调控有关外,与情感、植物神经等调控有关的核团也参与其中。 【关键词】偏头痛;电刺激;硬模;F o s 【中图分类号lR 3 3【文献标识码lA【文章编号】1 6 7 1 - 7 8 5 6 ( 2 0 1 0 0 2 - 0 0 3 0 - 0 4 D i s t r i b u t i o
3、 no fF o s I m m u n o r e a c t i v eN e u r o n si nC o n s e i o u sR a tB r a i na f t e r E l e c t r i c a lS t i m u l a t i o no fD u r an e a rS u p e r i o rS a g i t t a lS i n u s W A N GX i a o - l i n Y US h e n g - y u a n ,J I A N GL e t ,D O N GZ h a o ,W A N GX i a o h u t 。Z H O U
4、Z h i b i n ( D e p a r t m e n to fN e u r o l o g y ,T h eC h i n e s eP L AG e n e r a lH o s p i t a l ,B e i j i n g1 0 0 8 5 3 ,C h i n a ) 【A b s t r a c t 】O b j e c l i v e t oi n v e s t i g a t et h ed i s t r i b u t i o no fF o s i m m u n o r e a c t i v e ( I R ) n e u r o n si nc o n
5、 s c i o u sr a tb r a i n a f t e re l e c t r i c a ls t i m u l a t i o no fd u r an e a rs u p e r i o rs a g i t t a ls i n u s ( S S S ) M e t h o d sT h er a t sw e r ep r e p a r e dh ye x p o s u r eo ft h e s u p e r i o rs a g i t t a ls i n u s T h ed u r a m a t e rn e a rt h eS S SW a
6、l $ e l e c t r i c a l l ys t i m u l a t e da n d F o sp r o t e i nw l a b e l e db y i m m u n o h i s t o c h e m i c a ls t a i n i n g R e s u l t sA f t e rt h ee l e c t r i c a ls t i m u l a t i o n ,t h eF o s - I Rn e u r o n sw e r eo b s e r v e di nm a n ya r e a s i nt h eb r a i n
7、:t h eu p p e rc e r v i c a ls p i n a ld o r s a lh o r n ,s p i n a lt r i g e m i n a ln u c l e u sc a u d a l i s ,r a p h en u c l e i ,p e r i a q u e d u c t a lg r a y m a t t e r ,i n t e r p e d u n e u l a rn u c l e u s ,a n dh y p o t h a l a m u s ,C o n c l u s i o n sM a n ya r e a
8、 si n t h eb r a i nt a k ep a r ti nt h eo c c u r r e n c e a n dd e v e l o p m e n to fm i g r a i n e I na d d i t i o nt ot h en u c l e it r a n s m i t t i n ga n dm o d u l a t i n gp a i n ,t h o s er e f e r r i n ge m o t i o na n d a u t o n o m i cn e r v es y s t e ma r ea l s oi n v
9、o l v e d 【K e yw o r d s 】M i g r a i n e ;E l e c t r i c a ls t i m u l a t i o n ;D u r am a t e r ;F o s ;R a t 偏头痛是一种临床上常见的侵性、复发性脑功 能异常所致的原发性头痛。到目前为止,偏头痛的 发病机制仍未完全阐明,主要有血管源性学说、三 叉神经血管学说、皮层扩布性抑制学说等。针对不 同机制建立的多种偏头痛实验动物模型已被广泛 应用于偏头痛的发病机制、药物治疗、行为学观察 等研究中。 硬脑膜是颅内主要的伤害性感受组织,在偏头 痛的发病过程中起着重要的作用。硬脑膜神经源
10、 性刺激模型作为三叉神经血管反射学说所反映的 病理生理过程的典型代表,特别是电刺激上矢状窦 附近硬脑膜模型,目前被广泛运用于偏头痛的发病 【作者简介 王晓琳( 1 9 8 0 一) 女,博士在读,主要从事头痛的基础与临床研究。E m a r l :w a n g x l 8 0 1 2 6 e o m 。 【通讯作者 于生元( 1 9 6 3 一) ,男,主任医师,博士导师,长期从事头痛基础与临床的研究。E m a i l :y u s y l 9 6 3 1 2 6 c o m 万方数据 中国比较医学杂志2 0 1 0 年2 月第2 0 卷第2 期C h i nJC o m pM e d ,
11、F e b r u a f y2 0 1 0 ,V 0 1 2 0 N o 2 3 l 机制、药物治疗等方面的研究1 。电刺激硬脑膜使 得脑膜血管扩张加上扩张后释放炎症介质激活了 分布于硬脑膜上的三叉神经终末感受器,伤害性信 息沿三叉神经节、脊束核、丘脑传递至皮层,产生痛 觉,同时激活的三叉神经脊束核逆向调节神经终末 释放血管活性物质,进一步增强了伤害性信息,使 疼痛在程度和时间上都有所增加B 1 。然而,目前使 用的该模型基本上是建立在动物麻醉基础上的,对 给予刺激的幅度大小主要靠对动物实时心脏、血 压、呼吸等方面的监测来反映。 即使不考虑模型制备的复杂性,模型模拟的真 实性上也存在明显的问
12、题。因为偏头痛的患者不 可能在麻醉的情况下发病,麻醉不但可以减轻疼痛 的程度,也会减少剧烈疼痛可能引发的情感及自主 神经系统反应。因此,我们实验室建立了一种清醒 状态下电刺激上矢状窦硬脑膜观察动物行为学改 变的偏头痛实验动物模型,并从动物行为学、血液 流变、对吗啡的反应等方面进行了验证。为了进一 步明确该模型在给予相应电刺激后脑内的激活情 况我们设计了本实验。 1 材料和方法 1 1 实验动物分组 健康雄性S D 大鼠3 0 只,体重2 2 5 2 5 0g 。随 机分为实验组( 电刺激) 、对照组( 假手术) 和正常组 ( 空白) ,每组各l O 只。实验组以台式牙钻颅骨钻 洞暴露S S S
13、 后,安放电极并给予方波电流刺激2h ; 对照组除不给予电流刺激外所有操作同实验组;正 常组在麻醉后直接处死。所有实验动物均由解放 军总医院实验动物中心提供( 雄性S D 大鼠,S C X K ( 京) 2 0 0 6 - 0 0 0 9 ) 。 1 2 动物模型的建立 实验动物以1 0 水合氯醛( 0 4m L 1 0 0g ,解 放军总医院) 腹腔内注射麻醉后,剪掉头正中部毛 发,固定于立体定位仪上。消毒并逐层切开皮肤、 筋膜及骨膜以暴露颅骨。台式牙钻在颅骨上钻直 径约1m m 圆孔,取点方法为颅中线冠状缝交点前4 m m 后6m m ,暴露上矢状窦硬脑膜。将金属电极的 两极分别置于刺激孔
14、的硬脑膜上,并用牙科水泥固 定。7 5 酒精消毒切口及皮肤周围后缝合皮肤,将 大鼠置于原环境中静养,期间给予抗生素喂食( 阿 奠西林胶囊,按3 0m g k g 与食物混合喂食,3 日) , 环境中保持安静,室温在2 5 左右。大约4 5d 后,对实验组大鼠给予电刺激。采用日本光电工业 株式会杜生产的刺激器( S E N - 7 1 0 3 ) 和分离器( s S 1 0 2 J ) 给予电刺激2h ( D u r a t i o n = 5 0 ,I n t e r v e l = 2 5 0 ) 。实验结束后灌注固定动物。以上所有操作 均保证无菌条件,严格按照实验动物伦理委员会关 于动物实
15、验相关要求进行。 1 3 灌注固定及染色 所有动物以致死量1 0 水合氯醛腹腔注射麻 醉,插管至左心室,先以1 0 0m L 生理盐水冲洗血液, 再给予5 0 0m L 含4 多聚甲醛的0 1m o l L 磷酸缓 冲液( P B S ,p H7 4 ) 灌注固定。灌毕立即取脑,置于 上述新鲜固定液中后固定4h ,再移入含3 0 蔗糖 的P B S 中至组织块沉底( 4 。C ) 。将大鼠脑组织用恒 温切片机作连续冠状切片,切片厚度2 5p L m ,切片隔 2 张取一张,分3 套收集。 第1 套切片行免疫组织化学染色,具体步骤: 切片放入小鼠抗F o s 血清( 1 :5 0 0 ;C h
16、e m i c o n ) 室温下 孵育1 8 2 4h ;生物索标记的二抗室温下孵育4 h ;辣根过氧化酶标记得链霉卵自素室温下孵育 3 0r a i n ;二氨基联苯胺( D A B ) 中呈色,边反应边观 察,待免疫阳性细胞呈棕色时以蒸馏水终止反应。 上述抗体和复合物的稀释液均用含0 3 的T r i t o n X 一1 0 0 和0 。5 正常羊血清的P B S ,各步骤间用P B S 彻底清洗片子。最后将切片脱水透明封片并进行 观察。 第2 套切片用于正常小鼠血清的孵育,后续的 反应过程同上,进行替代对照试验。第3 套切片进 行N i s s l 染色,用以对照观察和定位免疫组织化
17、学染 色的阳性结果。 2 结果 镜下切片背景为棕黄色,F o s 免疫反应阳性神 经元星深棕黄色或深褐色,形状呈卵圆形或椭圆 形,直径在5 8u m 之间,与以往报道相同H 。 实验组F o s 免疫反应阳性神经元在脑内分布较 广泛,主要集中的高颈段脊髓后角、三叉神经脊柬 核尾侧亚核、中缝核簇、中脑导水管周围灰质、脚间 核、下丘脑、丘脑等部位。其中,高颈段脊髓后角、 三叉神经脊束核尾侧亚核、中缝核簇、中脑导水管 周围灰质的数量较多,与以往研究报道类似“ 1 。而 对照组的F o s 免疫反应阳性神经元在形态上与实验 组一致,但在分布位置和数量上存在明显差别:主 要分布在中脑导水管周围,数量较实
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