游离脂肪酸对大鼠胰岛β细胞胰岛素分泌及磺脲受体1基因表达的影响.pdf
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1、胰岛素抵抗及其相关疾病 游离脂肪酸对大鼠胰岛细胞胰岛素分泌及 磺脲受体1基因表达的影响 邓秀玲 袁莉 陈璐璐 周慜 【 摘要】 目的 研究游离脂肪酸(F F A) 对体外培养的大鼠胰岛细胞胰岛素分泌及磺脲受体1 (S UR 1) 基因表达的影响和机制。 方法 分离纯化胰岛细胞后分别与0. 2 5mm o l/L软脂酸(P A) 和 0 . 1 2 5mm o l/L油酸(OA) 温育4 8小时, 放免法检测胰岛素,R T - P C R检测S UR 1基因表达。 结果 与对照组比较,P A使基础胰岛素分泌增加1 1 0%(P0. 0 5) 。 结论 F F A抑制G S I S可能与其对胰岛细
2、胞S UR 1基因表达的 调节有关。 【 关键词】 脂肪酸; 胰岛素; 磺脲类受体 E f f e c t so f f r e e f a t t ya c i d so ni n s u l i ns e c r e t i o na n de x p r e s s i o no f s u l f o n y l u r e ar e c e p t o r1(S U R 1)g e n e i n r a tp a n c r e a t i cc e l l s D ENGX i u - l i n g,Y U ANL i,CHENL u - l u,e t a l.D e p a
3、 r t m e n t o fE n d o c r i n o l o - g y,U n i o n H o s p i t a l,T o n g j iM e d i c a lC o l l e g e,H u a z h o n gU n i v e r s i t yo fS c i e n c ea n dT e c h n o l o g y, W u h a n4 3 0 0 2 2,C h i n a C o r r e s p o n d i n ga u t h o r:Y U ANL i 【A b s t r a c t】 O b j e c t i v e T
4、oi n v e s t i g a t et h ee f f e c t so fF F Ao ni n s u l i ns e c r e t i o na n de x p r e s s i o no f S UR 1g e n e i nr a tp a n c r e a t i cc e l l s i nv i t r oa n d i t sm e c h a n i s m. M e t h o d s P a n c r e a t i c i s l e t c e l l so f r a t w e r e i s o l a t e d,c u l t u r
5、 e da n dc o - i n c u b a t e dw i t h0. 2 5 mm o l/Lp a l m i t i c a c i d(P A)a n d0. 1 2 5mm o l/Lo l e - i ca c i d(OA)r e s p e c t i v e l yf o r4 8h.T h er e l e a s e di n s u l i nw a sm e a s u r e db yr a d i o i mm u n o a s s a y .T h e S UR 1g e n emR NAe x p r e s s i o n w a sq u a
6、 n t i f i e db yR T - P C R. R e s u l t s C o m p a r e d w i t ht h ec o n t r o l g r o u p,p a l m i t i ca c i d i n c r e a s e dt h eb a s a l i n s u l i ns e c r e t i o nb y1 1 0%(P0 . 0 5) ,c o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o l g r o u p . C o n c l u s i o n s F F Ai n h i b i t sG S
7、 I S. F F A s r e g u l a - t i o no fS UR 1g e n ee x p r e s s i o no fc e l l sm a yb e i n v o l v e d i nt h e i n h i b i t i n ge f f e c t . 【K e yw o r d s】 F a t t ya c i d s;I n s u l i n;S u l f o n y l u r e ar e c e p t o r 2型糖尿病(T 2 DM) 患者由于肥胖、 脂代谢紊乱常存在 血浆游离脂肪酸(F F A) 水平增高。高浓度F F A从诱发
8、和加 重胰岛素抵抗(I R) 以及胰岛细胞功能障碍两个方面促进 DM病理生理的发生发展。近年来, 大量研究表明了脂毒性 的作用, 但关于脂毒性触发细胞功能障碍的分子机制仍未 阐明 1。本实验通过对体外分离培养的大鼠胰岛细胞研 基金项 目: 教 育 部 留 学 回 国 人 员 科 研 启 动 基 金 资 助 项 目 (2 0 0 2 2 4 7) , 湖北省自然科学研究基金资助项目(2 0 0 2 A B 1 3 6) , 武汉 市科技晨光计划研究基金资助项目(9 9 1 0 0 2 0 9) 作者单位:4 3 0 0 2 2 武汉, 华中科技大学同济医学院附属协和医 院内分泌科 通讯作者: 袁
9、莉 究F F A对胰岛素分泌的影响及其对S UR 1基因表达的调 节, 探讨脂毒性导致胰岛素分泌功能障碍的作用机制。 材料与方法 一、 实验材料 雄性S D大鼠, 体重2 0 02 5 0g, 华中科技大学同济医 学院动物中心提供;c D NA逆转录试剂盒( 美国MB IF e r - m e n t a s公司) , 胰岛素放免测定试剂盒( 北京北方生物技术 研究所) 。 二、 胰岛的分离纯化与细胞培养 根据改良的胶原酶方法 2分离胰岛, 纯化的胰岛细胞以 21 0 4个细胞团/ m l接种于9 6孔培养板内, 在R PM I 1 6 4 0 培养液中培养2 4h,将细胞分为A、B两组, 各
10、组又随机分为 29 中国糖尿病杂志2 0 0 6年第1 4卷第2期 C h i nJD i a b e t e s,A p r i l 2 0 0 6,V o l 1 4,N o2 对照(N C) 组、 软脂酸(P A) 和油酸(OA) 三组, 分别与空白、 0 . 2 5mm o l/LP A和0. 1 2 5 mm o l/L OA在 含2%牛 血 清 白蛋白, 5. 6 mm o l/L葡 萄 糖 的R PM I 1 6 4 0培 养 液 中 共 孵 育4 8h。 三、 胰岛素释放功能测定 培养结束后, 细胞用含0. 1%胎牛血清、 无糖的K R B B 缓冲液洗涤二次, 继之对A、B两
11、组细胞分别用5. 6或1 6. 7 mm o l/L葡萄糖作用1h, 以分析基础胰岛素分泌和葡萄糖 刺激的胰岛素分泌(G S I S) 功能。收集细胞上清液放免法测 定培养液中的胰岛素浓度。 四、R T - P C R分析 以T r i z o l试剂抽提培养细胞总R NA,R T - P C R技术测 定KA T P的亚单位S UR 1的mR NA水平。以- a c t i n作内 参 照。S UR 1引 物 序 列:上 游:C T G G GA T C AA C C T - GAGAG GA; 下 游:T T C T C C C A C G C A TAGAG C T T,产 物 大小:
12、4 0 0b p。内参照- a c t i n引物序列: 上游: C C TAAG G C - C AA C C G TAAG下 游:T C T T C A T G G T G C TAG GAG C C A, 产物大小: 6 2 3b p。取S UR 1和- a c t i n的扩增产物各2 0 l, 在2%琼脂糖凝胶上电泳, 光密度扫描后计算出S UR 1和其 对应的- a c t i n的光密度比值, 以此代表S UR 1的mR NA相 对转录量。 五、 统计学分析 数据 以- xs表 示, 各 组 间 差 异 分 析 用S t u d e n t st 检验。 结果 一、F F A对胰
13、岛细胞胰岛素分泌功能的影响 如表1所示,N C组中G S I S较基础胰岛素分泌显著升 高(P0. 0 5) ( 图1 B) 。 表1 游离脂肪酸对胰岛素分泌的影响( U /m l,- xs) T a b1 T h e e f f e c t o fF F Ao n i n s u l i ns e c r e t i o n( U /m l, xs) 组别 G r o u p 例数 n 基础胰岛素分泌 B a s a l i n s u l i n s e c r e t i o n 葡萄糖刺激的胰岛素分泌 G l u c o s e - s t i m u l a t e d i n s
14、u l i ns e c r e t i o n N C组69. 63. 15 5. 91 2. 8* P A组62 0. 05. 7*3 1. 99. 0* OA组61 7. 44. 3*3 8. 16. 9# 与对照组比较v sC o n t r o l,*P0. 0 1,#P0. 0 5 图1 F F A对S UR 1mRNA表达的影响 F i g1 T h ee f f e c to fF F Ao nt h ee x p r e s s i o no fS UR 1mRNA 与对照组比较v sN C, *P0. 0 1 讨论 目前关于F F A对胰岛细胞胰岛素分泌功能研究的结 果并不
15、一致, 这可能与实验条件不同有关。P A和OA分别 为最常见的饱和单不饱和脂肪酸, 本研究显示P A和OA慢 性孵育, 在基础状态下主要是对胰岛素分泌的刺激作用, 而 在葡萄糖刺激后却表现为明显的脂毒性, 即G S I S显著降 低。这与一些文献报道结果相一致 2, 证实了慢性脂毒性的 作用。 半定量R T - P C R方法显示在P A培养胰岛细胞后, 其 S UR 1表达较对照组有轻度下降, 而在OA作用后,S UR 1基 因表达较对照组显著降低, 表明F F A对胰岛素分泌功能的 影响可能与S UR 1基因表达的调节有关, 至少,F F A对G S I S 的抑制作用是部分通过对S UR
16、 1基因表达调节的介导。 在本实验中,P A与OA对胰岛素分泌的影响较为一致, 而S UR 1的表达在OA组有显著的变化, 在P A组S UR 1基 因表达变化 较 轻。分 析 其 原 因 如 下: (1)OA可 通 过 影 响 S UR 1的表达而影响细胞胰岛素分泌, 而P A可能主要通 过其他途径起作用。E i t e l等 3的研究显示 P A等饱和脂肪 酸引起细胞凋亡, 而OA等不饱和脂肪酸无此作用,M a e - d l e等 4的研究表明不饱和脂肪酸可预防或阻止饱和脂肪酸 引起细胞凋亡。由此, 我们亦可以推测, 在P A引起细胞 功能障碍的机制中, 凋亡和抑制细胞的有丝分裂可能是其
17、主 ( 下转第9 7页) 39 中国糖尿病杂志2 0 0 6年第1 4卷第2期 C h i nJD i a b e t e s,A p r i l 2 0 0 6,V o l 1 4,N o2 细胞内堆积可能与此相关 1 0。 参考文献 1 K l o p p e lG,L o h rM,H a b i c hK,e ta l . I s l e tp a t h o l o g ya n dt h e p a t h o g e n e s i so ft y p e1a n dt y p e2d i a b e t e sm e l l i t u sr e v i s i t e d .
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