抗原特异性细胞毒性T细胞体外扩增方法的研究近展.pdf
《抗原特异性细胞毒性T细胞体外扩增方法的研究近展.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《抗原特异性细胞毒性T细胞体外扩增方法的研究近展.pdf(5页珍藏版)》请在三一文库上搜索。
1、抗原特异性细胞毒性 T 细胞体外 扩增方法的研究近展 蔡志坚 摘要抗原特异性细胞毒性 T 细胞 (cytoxic T lymphocytes, CTLs) 在细胞免疫应答中起着重要的效应功 能, 从而在抗肿瘤和抗感染免疫中发挥着重要作用。由于受到各种因素的限制和影响, 抗原特异性 CTLs 无法在体内有效地诱导和扩增, 因此, 通过体外诱导和扩增 CTLs 后再将此 CTLs 回输到体内是一 个比较理想的方法, 且具有重要的应用价值, 如何高效激活和扩增抗原特异性 CTLs 是此法能否成功 应用的关键。 关键词抗原特异性细胞毒性 T 细胞; 过继性免疫治疗; 抗原提呈细胞; 抗原; 体外扩增
2、文章编号1673 - 4394 (2006) 02 - 0073 - 04中图分类号R392.11文献标识码A Recent Advance in Vitro Proliferation Methods of Antigen-specific CTLs CAI Zhi-jian (Institute of Immunology, Zhejiang University, Hangzhou 310031, China) AbstractAntigen-specific cytotoxic T lymphocytes(CTLs)have important effect on cell im- m
3、une response, therefore play a crucial role in the anti-tumor and anti-infection immunity.Howev- er, CTLs can not be induced and proliferated effectively in vivo because of various suppressive fac- tors.An ideal way to overcome this problem is the adoptive transfer with CTLs which have high applicat
4、ion value.The key point to carry out this way successfully is how to powerfully activate and expand antigen-specific CTLs. Key wordsAntigen-specific CTLs; Adoptive immunotherapy; Antigen-presenting cells; Antigen; Proliferation in vitro 基 金 项 目:国 家 重 大 基 础 研 究 计 划“ 973”免 疫 学 项 目 (2001CB510002) 作者单位:
5、 310031 杭州, 浙江大学免疫研究所 (硕士研究生) 审 校 者: 浙江大学免疫研究所王建莉曹雪涛 活化的细胞毒性 T 细胞 (CTLs) 能够分泌细胞因 子和细胞毒颗粒, 诱导靶细胞凋亡, 更重要的是能诱 导靶细胞裂解而直接杀伤病原体, 所以, CTLs 在抗肿 瘤和抗感染免疫中起着极其重要的作用。在体内, 由于共刺激分子的缺乏、 机体对病原体的免疫耐受、 各种 T 细胞抑制因子等因素的限制, 抗原特异性 CTLs 无法被有效地诱导和扩增。因而有人提出过继 性免疫治疗 (adoptive immotherapy) 的设想, 即通过在 体外给予各种有利于 T 细胞增殖的刺激, 从而有效
6、地诱导和扩增出抗原特异性 CTLs, 继而回输体内进 行治疗, 其中决定性的一步就是抗原特异性 CTLs 在 体外的有效扩增。随着抗原识别与提呈、 抗原提呈 细胞 (APC) 与 T 细胞相互作用以及 T 细胞活化和增 殖等基础研究的发展, 近年来人们创建了多种体外 扩增抗原特异性 CTLs 的新方法。 1荷载抗原的 DC 刺激抗原特异性 CTLs 扩增 抗原特异性淋巴细胞的活化、 增殖和分化极大 程度依赖于 T 细胞和 APC 之间的相互作用。在这个 过程中, 抗原来源的多肽与 APC 表面的 MHC 分子形 成复合物被提呈给 T 细胞抗原受体 (TCR) , 然后激活 T 细胞。DC、 巨
7、噬细胞、 B 细胞是专职的 APC, 其中 DC 作用最强, 它具有独特的刺激初始 (naQve) T 细胞 活化的能力。所以, 抗原特异性 CTLs 体外扩增的大 部分研究是建立在应用 DC 基础上的。 1.1导入目的抗原基因的 DC 诱导抗原特异性 CTLs 扩增 37国际免疫学杂志 2006 年 3 月第 29 卷第 2 期International Rournal of Immunology, March 2006, Sol 29.To.2 鼻咽癌和霍奇金病的发生与 EBV 感染有关, 这 些肿瘤细胞能表达一些具有潜在免疫原性的 EBV 抗 原如 LMP1 和 LMP2a, 可 作 为
8、 CTLs 的 靶 抗 原。Su 等 1通过阳离子脂质体, 将 LMP2aRNA 导入到自体 DC, 再将此 DC 与健康供者和患者来源的外周血单 个核 细 胞 (PBMCs) 在 体 外 共 同 培 养, 结 果 显 示, LMP2a 特异性 T 细胞大量扩增并具有显著的杀伤 EBV 阳性靶细胞的活性。提示这些体外成功扩增的 LMP2a 特异性 T 细胞可以应用于 EBV 阳性肿瘤的过 继性免疫治疗。也有人用基因治疗载体如裸 DNA、 腺病毒、 逆转录病毒等将目的抗原导入 DC, 再以表 达目的抗原的 DC 体外诱导抗原特异性 CTLs 扩增也 获得了成功。 1.2抗原冲击而致敏的 DC 诱
9、导抗原特异性 CTLs 扩增 胰腺癌细胞表达多种潜在的具有免疫原性的肿 瘤抗原包括癌胚抗原 (CEA) 、 HER-2/neu、 MUC-1、 mu- tant ras 和 p53, 以往的瘤苗多数是针对其中某一种抗 原而设计的, 但这样的设计是有缺陷的, 因为并不知 道哪个抗原具有诱导机体有效的抗肿瘤免疫反应的 潜能。应用肿瘤细胞裂解物能够克服这个缺陷, 因 为肿瘤细胞裂解物包含大量已知或未知的抗原, 它 们能够通过 MHC-类和 MHC-类途径提呈给 T 细 胞而活化针对多个肿瘤抗原的 CTLs, 因此以肿瘤细 胞裂解物冲击而致敏的 DC 更有可能诱导多克隆 T 细胞的扩增。Schnurr
10、 等 2将肿瘤细胞裂解物与病人 单核细胞来源的 DC 共同培养, 再将培养后的 DC 与 病人来源的 PBMCs 在体外培养, 结果能大量扩增出 针对胰腺癌细胞的具有杀伤活性的 CTLs。 1.3经病毒颗粒递送而更高效捕获抗原的 DC 诱导 抗原特异性 CTLs 扩增 如何更高效地向 DC 提呈抗原, 是影响 DC 免疫 治疗效果的关键。Moran 等 3利用委内瑞拉马脑炎 病毒复制子颗粒 (Venezuelan equine encephalitis virus replicon particles, VRPs) 将 VRP 编码的流感基质蛋白 (FMP) 递送到人单核细胞来源的 DC, 结
11、果发现与直 接以 FMP 冲击致敏的 DC 相比, 前者更能刺激 CD8 + CTLs 的体外扩增 3。 荷载抗原的 DC 因其具有很强的诱导抗原特异 性 CTLs 扩增的能力, 提示以 DC 为基础的抗原特异 性 CTLs 扩增具有很大的临床应用价值。目前大量 的研究集中在以荷载肿瘤抗原的 DC 为疫苗, 激发体 内肿瘤抗原特异性 CTLs 增殖而达到抗肿瘤的效果。 但从另一个角度, 即通过荷载肿瘤抗原的 DC, 体外 诱导扩增出肿瘤抗原特异性 CTLs, 再进行过继性免 疫治疗, 这样也许更有可能打破体内一些限制肿瘤 抗原特异性 CTLs 活化的因素, 从而达到更好的临床 治疗效果。 2人
12、工抗原提呈系统刺激抗原特异性 CTLs 扩增 专职的 APC 在刺激 T 细胞扩增的能力上各有差 异。这些细胞的分离和扩增既复杂又耗时, 而且受 T 细胞的人类白细胞抗原 (HLA) 型别的限制。因此, 探索一种迅速高效扩增 T 细胞的新方法将具有更 广泛的应用前景。实际上任何表达 HLA 分子的细 胞都是一个潜在的 APC, 如果通过人为的方法使一 些细胞或非细胞系统表达 HLA 分子以及抗原提呈 所必需的共刺激分子, 可以使它们具备不同程度的 抗原提呈能力, 从而利用它们去体外扩增 CTLs。据 此, 有人构建了一类人工抗原提呈系统, 此系统分为 以细胞为基础的和非细胞为基础的两种。这些方
13、法 中, 一部分是抗原特异性 CTLs 扩增, 另一部分则是 非特异性淋巴细胞扩增 4。 2.1以细胞为基础的人工抗原提呈系统诱导抗原 特异性 CTLs 扩增 迄今为止, 已经有 3 种以细胞为基础的人工抗 原提呈系统, 分别来自于昆虫细胞、 鼠成纤维细胞和 人类白细胞系 4。昆虫细胞来源的人工抗原提呈细 胞中具有代表性的是黑腹果蝇细胞, 因为它不能荷 载内源性抗原肽到最新合成的 MHC-类分子, 故能 为外源性抗原肽荷载的研究提供一个很好的可控系 统。P369-377 是黑色素细胞来源的、 HLA-A2.1 限制 性的、 酪氨酸酶基因编码的九肽。Mitchell 等 5用 p369-377
14、冲击致敏 HLA-A2.1 + CD80 + CD54 + 黑腹果 蝇细胞, 然后将冲击致敏后的黑腹果蝇细胞与 1 1010人 PBMCs 共同培养, 结果在一个月内扩增出了 1 109CTLs, 其中 10% 30% 是黑色素细胞抗原特 异的,提示该方法有望应用于黑色素瘤的免疫治 疗。为了研究鼠成纤维细胞是否能够成为潜在的 APC, Latouche 等 6将 CD80、 CD54、 CD58、 HLA-A2. 1 和2 微球蛋白基因转染到鼠成纤维细胞, 同时为了 构造完整的 APC 而不需要外源性多肽, 他们将基因 编码的 CTL 表位通过与 CD8前导肽融合而靶向到 内质网。将基因修饰后
15、的鼠成纤维细胞与外周血来 源的 HLA-A2.1 + T 细胞共同培养, 发现 CD8 + T 细胞 选择性的扩增并分化成流感病毒基质蛋白或黑色素 细胞抗原 Mart-1、 gp100 特异的 CTLs。K32 是慢性红 细胞白血病细胞系来源的、 被转染 CD32 之后再包被 抗 CD3 和抗 CD28 鼠 IgG 单克隆抗体 (monoclonal anti- 47国际免疫学杂志 2006 年 3 月第 29 卷第 2 期International Journal of Immunology, March 2006, Vol 29.No.2 bodies, mAbs) 的 HLA-A - B
16、 - C + DR - 细胞。Maus 等 7 将 K32 与从 500ml 外周血分离获得的 T 细胞共同培 养, 在一个月内扩增出了 1 1010T 细胞。虽然 K32 介导的扩增并非抗原特异的, 但是, K32 一旦包被上 四聚物或 Ig-HLA 融 合 分 子 就 能 诱 导 抗 原 特 异 性 CTLs 的体外扩增。 2.2非细胞为基础的人工抗原提呈系统诱导抗原 特异性 CTLs 扩增 非细 胞 系 统 包 括 磁 珠、 脂 质 体 及 exosomes 4。 Oelke 等 8将黏附 HLA-I-免疫球蛋白融合分子 (HLA- I-Ig) 和抗 CD28 单抗的磁珠与从人 PBMC
17、s 分离的 1 106CD8 + T 细胞共同培养 7 周之后, 发现 CD8 + T 细胞扩增了 1 000 倍, 而且大于 85%的 CTLs 是 Mart- 1 特异性的, 这比自体抗原肽冲击的 DC 具有更强的 激发特异性 CTLs 扩增的能力。Prakken 等 9将 MHC- 类分子植入单层的脂质体, 再以适当的抗原肽冲 击。将修饰后的脂质体与鼠 源 的、 抗 原 肽 特 异 的 CD4 + T 细胞在体外混合培养, 结果观察到了 T 细胞 的大量扩增和高水平 IL-2 的分泌, 提示扩增出有功 能活性的 CTLs。exosomes 是细胞分泌的约 60 90nm 大小的微囊泡,
18、可在体外培养肿瘤细胞、 B 细胞及 DC 的过程中分离其上清获得, B 细胞和 DC 来源的 exo- somes 表达 MHC-、 MHC及某些共刺激分子如 B7- 2。抗原肽还可以直接荷载到纯 化 的 exosomes 10。 Craca 等 11最先报道过 B 细胞来源的 exosomes 作为 人工抗原提呈颗粒能在体外有限的诱导 CD4 + T 细 胞扩增, 随后 Utsugi-Kobukai 等 12研究发现 BM-DC 来 源的 exosomes 能在体外直接诱导 CD8 + T 细胞扩增, Sprent 等 13也报道了 DC 来源的 exosomes 能在体外 直接诱导 CD8
19、 + T 细胞扩增。 2.3人工抗原提呈系统诱导扩增的抗原特异性 CTLs 的过继性免疫治疗研究 目前已经有 3 种人工抗原提呈系统进入临床研 究阶段, 它们是 CD3/CD28 磁珠、 黑腹果蝇细胞和 ex- osomes。在 HIV 病人 I 期临床试验中, 给患者回输经 CD3/CD28 磁珠体外诱导的 3 1010CD4 + T 细胞, 结果 可以观察到病人外周血中病毒载量的明显下降及 CD4 + T 细胞数量稳定缓慢的上升 14。给恶性非霍 奇金 (NHL) 淋巴瘤病人单次回输经 CD3/CD28 磁珠 体外诱导的 (2.5 10) 109自体 CD3 + T 细胞, 结果 有病人出
20、现肿瘤消退, 而且超过两年 15。在晚期黑 色素瘤病人期临床试验中, 将酪氨酸酶基因编码 的九肽 p369-377 冲击致敏 HLA-A 2.1 + CD80 + CD54 + 黑腹果蝇细胞, 再以此细胞体外诱导 T 细胞扩增。 给 10 位患者回输 5 108扩增的 T 细胞后, 其中有两 位患者出现部分临床应答, 而且在这两位患者的肿 瘤组 织 中 均 可 观 察 到 酪 氨 酸 酶 的 表 达 及 CD4 + 、 CD8 + 和 CD16 + 细胞浸润增多 5。在 /期黑色素 瘤病人的期临床试验中, 给 15 位患者回输由自体 DC 上清中分离纯化而获得的 exosomes, 结果有 5
21、 位 患者表现出有限的临床应答 16。人工抗原提呈系统 为 CTLs 的过继性免疫治疗开辟了一条新思路, 但同 时也存在着临床应用上的安全性及有效性问题, 因 此还有待于进一步研究。 3抗独特型抗体与人类 IgG1 嵌合抗体刺激抗原特 异性 CTLs 扩增 CEA 是一种常见的肿瘤标志物, 许多肿瘤细胞 表面表达这种细胞表面蛋白。鼠抗独特型抗体 (anti- idiotype, AId) 708 可以模拟 CEA, 能在体外诱导 CEA 特异性的 CTLs 扩增。但单独的鼠 AId 708 不能有效 诱导 CTLs 扩增, CTLs 的大量扩增需要将抗原高效地 靶向到 APC。Parsons
22、等 17将 AId 708 与人类 IgG1 抗 体嵌合, 通过 IgG1 的 Fc 段与抗原提呈细胞表面的 FcR 相互作用, 将抗原靶向到 APC, 进一步诱导 CTLs 的扩增。将 AId 708 与人类 IgG1 嵌合体与不同 HLA 型别的健康供者来源的 PBMCs 在体外共同培养, 结 果能有效地诱导 CEA 特异性 CTLs 的扩增, 因而 AId 与人类 IgG1 嵌合抗体为如何将目标抗原高效地靶 向到 APC 提供了一条新的思路, 从而更高效地在体 外诱导抗原特异性 CTLs 扩增。 4B 细胞表位、 CTL 细胞表位及辅助性 T 细胞表位 连接多肽刺激抗原特异性 CTLs
23、扩增 CTLs 能够通过识别病毒来源的短的多肽分子杀 伤病毒及被病毒感染的细胞, 因此乙型肝炎病毒 (HBV) 抗原肽特异性 CTLs 在控制 HBV 感染和清除 被 HBV 感染的细胞中起着关键性的作用 18。应用 由一 系 列 病 毒 模 拟 抗 原 的 免 疫 优 势 表 位 (immu- nodominant epitope) 组成的合成多肽有可能激活 HBV 抗原特异性 CTLs 反应并且在某种程度上打破机体 对 HBV 抗原的免疫耐受。据此, Shi 等 19将来自于 HBV PreS2 18-27 区域的 B 细胞免疫优势表位、 核心 抗原 18-27 (HBcAg18-27)
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 抗原 特异性 细胞 毒性 体外 扩增 方法 研究
链接地址:https://www.31doc.com/p-3715265.html