日本脑炎病毒受体功能缺陷细胞与亲代细胞膜分子差异的鉴定.pdf
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1、第8 卷第1 8 期2 0 0 8 年9 月 1 6 7 1 1 8 1 9 ( 2 0 0 8 ) 1 8 - 5 1 5 5 0 6 科学技术与工程 S c i e n c e1 诎n o l o 盯a n dE n g i l 雠r i I l g “ C o L8N o 1 8 S 印2 0 0 8 2 0 0 8 虢T e c k E n g n 昏 日本脑炎病毒受体功能缺陷细胞与亲代 细胞膜分子差异的鉴定 任君萍马文煜丁天兵 ( 第四军医大学基础部微生物学教研室,西安7 1 0 0 3 2 ) 摘要鉴定日本脑炎病毒( J E V ) 受体功能缺陷细胞3 A I O - 3 F 与亲
2、代细胞B H K - 2 1 膜分子表达的差异,以发现J E V 受体候选 分子。3 A 1 0 - 3 F 与B H K - 2 1 细胞膜蛋白用氯仿去脂法分别提取,通过二维电泳( 2 - D E ) 分离。经I m 嘴e M a s t e r2 D 软件分析比较 后,选取差异点做液质联用质谱分析( L C - M S M S ) 。发现有2 3 个蛋白点在两组2 一D E 凝胶中有显著差异表达,L c M S M S 鉴 定了1 4 个蛋白质,其中有4 个膜蛋白,即钙结合蛋白a n n e x i nI ,a n n e x i n2 ;电压依赖的离子通道( V D A C s ) 蛋白
3、V D A C1 ,V D A C 2 。上述结果为深入鉴定J E V 受体分子特性与功能,阐明J E V 致病机理提供了线索。 关键词日本脑炎病毒( J E V )受体二维电泳( 2 一D E )质谱( M S ) 中图法分类号1 1 3 7 3 3 1 ;文献标志码B 日本脑炎病毒( J a p a n e s ee n c e p h a l i t i sv i r u s ,J E V ) , 我国又称乙脑病毒,属于黄病毒科黄病毒属,是有囊 膜的正链R N A 病毒。删引起的流行性乙型脑炎 ( 乙脑) ,是一种严重的急性中枢神经系统传染病。 病毒与细胞表面相应受体的结合是病毒感染复制
4、过 程中的始动环节,也是影响病毒宿主特异性、组织亲 嗜性和致病性的决定因素之一。目前,J E V 在易感细 胞上的受体分子及其特性与功能仍然不清楚。 建立并筛选病毒特异性受体缺陷细胞系,或对 病毒感染有抗性的细胞系,将为鉴定病毒受体分子 提供有力的工具。本课题组应用化学方法诱变 J E V 易感细胞B H K - 2 1 ,经J E V 攻击,筛选建立了一 株J E V 受体功能缺陷细胞系3 A l O 一3 F 【2 J 。3 A l O 一 3 F 细胞与J E V 的结合率显著下降,仅为2 1 ;其 对J E V 的感染有相当程度的特异性抵抗,在J E V 感 染复数为M O I1 时,
5、3 A l O 一3 F 细胞培养上清中皿V 2 0 0 8 年6 月2 5 日收到国家自然科学基金( 3 0 6 0 0 5 2 6 ,3 0 4 7 0 0 9 1 ) 资助 第一作者简介:任君萍( 1 9 r 7 2 一) ,女,陕西扶风人,博士。E - m a i l : j I l 川血瑁r 国f r a m e e d e o 通信作者简介:丁天兵。剐教授。 最高滴度比B H K - 2 1 细胞中J E V 最高滴度下降两个 数量级。由此推测3 A l O 一3 F 细胞的某些膜分子表 达发生了变化,进一步鉴定这些膜分子可能发现某 些具有病毒受体功能的新的未知宿主蛋白。本研 究应
6、用蛋白质组学的方法,即二维电泳( t w o d i m e n - s i o n a le l e c t r o p h o r e s i s ,2 - D E ) 组合液质联用质谱( L c M S M S ) 技术,重点观察了3 A 1 0 - 3 F 细胞与B H K - 2 1 细胞膜分子的表达差异。 l 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 细胞 B H K - 2 1 细胞为本室保存,3 A 1 0 - 3 F 细胞为本课 题组建立。 1 1 2 试剂 蛋白酶抑制剂( M i n i C o m p l e t e ) 购自R o c h e 公 司。苯甲基磺酰氟( P M
7、 S F ) 、T r i t o nX 1 0 0 、丙烯酰 胺、甲叉双丙烯酰胺、二硫苏糖醇( D T r ) 、尿素( u 静 a ) 、硫脲( t h i o u r e a ) 、3 - ( 3 - 胆酰胺丙基) 一二乙胺 - 丙 磺酸( C H A P S ) 、i o d o a e e t a m i d e ( 姒) 购自S i g m a 公 司。8 5 t r i b u t y l p h o s p h i n e ( T B P ) 购自F l u k a 公司。 万方数据 5 1 5 6科学技术与工程8 卷 甘露醇( m a r m i t 0 1 ) 、蔗糖( s
8、 u c r o s e ) 、H E P E S 购自 M e r c k 公司。1 3c mp H3 1 0 线性I P G 预制胶条、 I P G 缓冲液p H3 1 0 、低分子量蛋白标准均购自 A m e r s h a m P h a r m a c i aB i o t e e h 公司o 1 2 方法 1 - 2 1 氯仿去脂法提取细胞膜蛋白 参考文献 3 ,分别提取3 A 1 0 - 3 F 细胞与B H K 一 2 l 细胞的膜蛋白。长满单层的1 1 0 8 个细胞,用 P B S ( 含1 0 0m g LP M S F ) 洗三次,用含蛋白酶抑制 剂的冷分离缓冲液( 2
9、 0 0m m o l Lm a n n i t o l ,7 0m m o L L $ u c r o f l e 。1 0m m o L LH E P E S ,1m m o l LE D T A ,p H 7 4 ) 1m L 重悬细胞,冰浴超声3 次。细胞沉淀重 悬于含0 1 B S A 的冷分离缓冲液中,离心( 4 0 C 、 l0 0 0g r a i n 、1 5m i n ) ,弃上清。细胞蛋白沉淀中加 l m L 氯仿室温振荡孵育lh ,再加入l :l 的甲醇去 离子水lm L 剧烈振荡1 0m i n 。离心( 20 0 0g r a i n 、 1m i n ) ,吸弃氯
10、仿层。重复氯仿去脂一次。冷丙酮 沉淀膜蛋白后,B r a d f o r d 法蛋白定量,分装- 7 0 。C 保 存备用。 L2 2 二维电泳( 2 。D E ) 突变细胞与B H K - 2 1 细胞的膜蛋白样品送西安 交通大学生命科学院生物信息研究中心做二维电 泳,分析差异点。用1 3c m 线性p H 3 1 0 预制胶 条,上样量5 0 峭膜蛋白。参照I P Gp h o r 等电聚焦 系统指南,程序设置如下:1 ) 6 0V ,1 2h ,S t e pa n d H o l dm o d e ;2 ) 2 0 0V ,2h ,S t e pa n dH o l dm o d e
11、;3 ) 5 0 0V ,2h ,G r a d i e n tm o d e ;4 ) 10 0 0V ,1h ,G r a d i e n t m o d e ;5 ) 80 0 0V ,1h ,G r a d i e n tm o d e ;6 ) 80 0 0V , S t e pa n dH o l dm o d e 。总电压时间为3 0k V h T 。将胶 条在1 0m L 含有1 聊【T I 的平衡缓冲液中( 6m o L L u 阳a 。3 0 g l y c e r i n 。4 S D S ,5 0m m o l LT r i s H C I p U8 8 ) 室温平衡1
12、 5 幽后,再用含2 5 I 从的 平衡缓冲液室温平衡1 5m i n 。在S D S P A G ES E 6 0 0 电泳系统进行第二相电泳。电流条件为:先1 0m A 3 0m i n ,再2 0m A 直到溴酚蓝跑至距胶底o 5 1c m , 停止电泳。按蛋白质银染试剂盒的操作手册进行银 染。在相同条件下,对突变细胞与B I t K - 2 1 细胞的膜蛋 白样品分别进行了三次2 - D E 检测。 1 2 3 凝胶图像分析 银染的凝胶经S c a n M a k e r8 7 0 0 扫描仪扫描后, 图像保存为r 1 1 F 格式,输入分析软件I m a g e M a s t e
13、r2 D P l a t i n u mS o f t w a r e5 0 ( A m e r s h a m P h a r m a c i a ,S w e - d e n ) ,进行背景消减、点检测、匹配、获取斑点位置 坐标等分析。选取表达量差异2 倍以上的点作为后 续质谱分析的候选蛋白质点。 1 2 4 L C M S M S 分析及数据库查询 将需要进行鉴定分析的差异蛋白点从2 - D E 凝 胶中切下,送中科院动物所生物膜与膜生物工程国 家重点实验室,进行L C M S M S 分析。经过冲洗, 脱色,胶内酶切,萃取及冻千,将制备好的样品置于 H P L CS u r v e y
14、 o r 系统及L C QD e c aX PP l u sS y s t e m 质 谱仪上进行分析。将肽指纹图谱的数据输入N C B I 蛋白质网站数据库的子库( 物种名称为m o u s e ) ,用 检索软件( B i o w o r k s3 1 中的S E Q U E S T ) 对蛋白质点 的分子量、等电点、匹配肽段的多少和覆盖率等进 行综合分析、鉴定。 2 结果 2 12 - D E 检测3 A 1 0 - 3 F 细胞与B H K - 2 1 细胞膜蛋 白的差异 3 A 1 0 - 3 F 细胞与B H K - 2 1 细胞膜蛋白2 一D E 银 染图谱如图l 所示。经图像扫
15、描后,应用I 孙 a g e M a s t e r2 DP l a t i n u mS o f t w a r e5 0 软件对图像进行 分析,结果显示3 A l O - 3 F 细胞样本三次重复凝胶图 谱之间点偏差( v a r i a t i o nc o e f l l c i e n t so nt h es p o tn t i m h e r s ) 为9 2 ,平均检测到的蛋白质点数为6 9 0 点; B H K - 2 1 细胞样本三次重复凝胶图谱之间点偏差为 8 7 ,平均检测到的蛋白质点数为7 1 0 点。以B H K 2 1 细胞为对照,定量差异表达分析( 表达量相差
16、2 倍以上) 发现有2 3 个蛋白质斑点在两组凝胶中有 显著差异表达( 图1 与表1 ) 。差异点分为三类,第 一类是与对照组相比,3 A 1 0 - 3 F 细胞样本中有蛋白 质表达上调( 六个点,即s p o t s1 l 一1 2 ,1 4 ,1 7 ,1 9 , 2 1 ) 或下调( 六个点,即s p o t s1 ,4 7 ,9 ) 。第二类 是对照组为空白,仅仅表达在3 A 1 0 - 3 F 细胞样本中 的蛋白质( 七个点,s p o t s1 3 ,1 5 一1 6 ,1 8 ,2 0 ,2 2 万方数据 1 8 期任君萍,等:乙脑病毒受体功能缺陷细胞与亲代细胞膜分子差异的鉴定
17、 5 1 5 7 2 3 ) 。第三类是3 A l O - 3 F 细胞为空白,仅仅表达在 8 ,1 0 ) 。 B H K - 2 1 细胞样本中的蛋白质( 四个点,s p o t s2 _ 3 , 图l3 A 1 0 - 3 F 细胞( a ) 和B H K - 2 1 细胞( b ) 膜蛋白的2 - D E 图 表13 A 1 0 - 3 F 细胞和B H K - 2 1 细胞差异表达的蛋白点 :+ 1 0 0 代表仅仅表达在参考胶( r d e r e n c eg e l ) B H K - 2 1 上的点; 一1 0 0 代表仅仅表达在样品胶( s a m p l eg e I )
18、 3 A 1 0 - 3 F 上的点 2 2L C - M s M S 分析及数据库查询 将以上2 3 个差异蛋白质点从2 一D E 凝胶中切 下,进行胶内酶切和L c M S M S 分析。结合数据库 检索,鉴定了1 4 个蛋白质( 表2 ,s p o t s1 ,3 5 ,7 , 1 0 1 2 1 4 1 6 ,2 0a n d2 2 2 3 ) ,均有较多的匹配 肽段数及较高的氨基酸序列覆盖率。根据N C B I n r 网站蛋白质数据库提供的蛋白质功能信息,被鉴定 的1 4 个蛋白质按功能不同可分为六种:钙离子结合 ( C a l c i u m b i n d i n g ) 蛋白
19、,离子通道( I o nt r a n s p o r t a - t i o n ) 蛋白,蛋白结合( P r o t e i nb i n d i n g ) 分子,信号转 导( s i g m lt r a n s d u c t i o n ) 分子,核糖体( R i b o s o m a l ) 蛋 白以及代谢酶( M e t a b o l i s m ) 。其中有四种膜蛋白, 即钙结合蛋白a n n e x i nl ,a n n e x i n2 ;电压依赖的离 子通道( V D A C s ) 蛋白V D A C1 ,V D A C2 。 万方数据 5 1 5 8 科学技术
20、与工程8卷 3 讨论 受体篙鬻要芋纂= 黧絮 通过鉴定病毒的受体可以促进对病毒致病机次鉴定了J E V 受体功能缺陷的细胞系3 A 1 0 - 3 F 与 理的认识。一旦病毒受体的特性与功能被确定,将亲代B H K - 2 1 细胞上有明显差异表达的四种膜蛋 对研制有效的抗病毒药物和疫苗提供依据。白,即钙结合蛋白a n n e x i n1 ,a n n e x i n2 ;电压依赖的 万方数据 1 8 期任君萍,等:乙脑病毒受体功能缺陷细胞与亲代细胞膜分子差异的鉴定 5 1 5 9 离子通道( V D A C s ) 蛋白V D A Cl ,V D A C2 。这些膜 蛋白介导J E V 吸
21、附穿入细胞的特异性作用是未 知的。 a n n e x i n s 分子是一类结构相似的蛋白家族,它 们的共同特性是都能以钙离子依赖的方式结合磷 脂膜和细胞膜。a n n e x i n1 参与多种细胞功能,包括 膜融合、胞外分泌、分化、凋亡、钙离子通道以及与 细胞骨架蛋白相互作用【4 J 。目前仅有一篇文献报 道涉及a n n e x i n1 在病毒感染细胞中的作用。研究 发现 ,感染性胰腺坏死病毒( I P N V ) 对鱼细胞的感 染,使a n n e x i n1 在细胞膜上表达升高,从而抑制 I P N V 感染细胞的凋亡,促进I P N V 在细胞中的增 殖。另有几篇文献报道涉及
22、a n n e x i n2 在病毒感染 中的作用。如最近a n n e x i n2 被鉴定为巨细胞病毒 ( C M V ) 和呼吸道合胞病毒( P 6 V ) 的受体 7 J 。a n n e x i n2 能够促进H I V 一1 穿入细胞,在病毒装配中 起关键的作用哺】。本研究发现3 A l O - 3 F 细胞上a n - n e x i n1 和a n n e x i n2 的表达明显地下降。根据上述 a n n e x i n1 与a n n e x i n2 的功能,这两个分子有可能通 过与脂膜的相互作用与皿V 的结合相关。所以a n - n e x i n1 与a n n e
23、 x i n2 在3 A 1 0 - 3 F 细胞上表达的下调, 导致J E V 与3 A l O - 3 F 细胞膜的结合能力也明显下 降了。 V D A C s 蛋白是一个进化保守的多基因家族,是 存在于真核细胞线粒体外膜的多孔疏松性蛋白质, 控制A T P 与A D P 转运的动态平衡。然而,多个研 究小组报道【州l 】V D A C s 蛋白也存在于多种类型的 细胞膜上,参与细胞膜电压调节及细胞的凋亡。 V D A C1 通过一种鼠细胞的细胞膜调节A T P 的转 运训。B a k e r 等 ”】观察到在细胞膜上,V D A CI 以 N A D H 依赖的铁氰化物还原酶的形式抑制A
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- 日本 脑炎 病毒 受体 功能 缺陷 细胞 亲代 细胞膜 分子 差异 鉴定
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