汗防已甲素联合塞来昔布逆转白血病细胞耐药的体外研究.pdf
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1、第 15 卷第 5 期 2005 年 10 月 江 苏 大 学 学 报 (医 学 版) Journal of Jiangsu University (medicine) Vol. 15No. 5 Oct. 2005 汗防已甲素联合塞来昔布逆转白血病细胞耐药的体外研究 顾红兵1, 2,许文林3,王法春3,江云伟3, 缪竞诚1 (1. 苏州大学医学院基础医学系, 江苏 苏州 215007; 2. 江苏大学附属人民医院检验科; 3. 江苏大学附属人民医院中心实验室, 江苏 镇江 212002) 摘 要 目的:通过汗防已甲素联合塞来昔布逆转白血病细胞耐药的实验研究, 探讨有关多药联合逆转肿瘤细胞 的耐
2、药机制。方法:噻唑蓝 (MTT) 比色法检测汗防已甲素联合塞来昔布对 K562 细胞的细胞毒试验; 用流式细胞技术 (FCM) 检测各组 K562 细胞内的药物浓度; 用 FCM 检测各组的早期凋亡 (Annexin V) ; 用 RT-PCR 检测各组 COX-2/ COX-1 的表达。结果:汗防已甲素联合塞来昔布对 K562 细胞的抑制作用与其他组相比有显著性差异 (P 0. 05) ; 细 胞内的药物浓度高于其他实验组; 诱导凋亡率 (17. 67%) 高于其他实验组; COX-2/ COX-1 的表达明显低于其他实验 组。结论:汗防已甲素联合塞来昔布逆转 K562 细胞的效果明显, 能
3、够增加 K562 细胞内药物浓度, 诱导细胞凋亡, 降 低 COX-2/ COX-1 的表达。 关键词 汗防已甲素;塞来昔布;耐药性;多药;细胞系;K562 细胞;凋亡 中图分类号 R -33 文献标识码 A 文章编号 1671 -7783 (2005) 05 -0390 -04 In Vitro Study of the Reversal Effect of Tetrandrine Combining with Celecoxibon Multidrug Resistance in Leukemia Cell Line GU Hong-bing1, 2,XU Wen-ling3,WANG F
4、a-chun3,JIANG Yun-wei 3,MIAO Jing-cheng1 (1. Department of Celluar and Molecular Biology,Medical School of Suzhou University,Suzhou Jiangsu 215007; 2. Clinic Lab; 3. Central Laboratory,the Affiliated People s Hospital of Jiangsu University,Zhenjiang Jiangsu 212002, China) Absract Objective:To invest
5、gate whether tetrandrine combining with celecoxib can reverse multidrug resistance in leukemia cell line K562 and explore its possible mechanism. Methods:Cytotoxic effect of tet- randrine alone and tetrandrine combining with celecoxib on K562 cell line was detected using MTT colori- metry;apoptosis
6、and intracelular drug concentration were determined by flow cytometry (FCM) ;the expres- sion of COX-2/ COX-1 was detected using RT-PCR. Result:Compared with other groups,combination of tetrandrine and celecoxib had stronger inhibition effect on K562 cell line and higher intracelular drug con- centr
7、ation and apoptisis percentage (17. 67%) ,however,the expression of COX-2/ COX-1 was lower than other groups. Conclusin:Tetrandrine combining with celecoxib can reverse the multidrug resistance,the underlying mechanism may attribute to increaseing intracelular drug concentration、 induction of apopto
8、sis and down-regulation of mRNA expression of COX-2/ COX-1。 Key words Tetrandrine;Drug resistance;Multiple;Celecoxib;Cell line, K562;Apoptosis 白血病细胞多药耐药 (Multidrug resistance, MDR) 的出现是化疗失败的主要原因, 是多因素和 多种机制共同作用的结果。某些研究表明, 白血病 获得性 MDR 的主要机制与多药耐药基因 mdr1 及 其蛋白 P-糖蛋白 (P-gp) 高表达相关, 他们能将细胞 内的化疗药物主动泵出细胞外,
9、致使细胞耐药1, 2。 汗防已甲素 (Tetrandrine, TTD) 是中药汗防己科千金 藤属植物粉防己块根中的主要成分, 是一种非特异 性的 Ca2 +通道阻滞剂, 研究表明他可以调节多种 P- gp 介导的 MDR 细胞株的耐药 3。塞来昔布 (Cele- coxib CELE) 是一种非甾体类的抗炎药, 药动力学研 究显示其为长效药物, 选择性抑制 COX-2 的活性, 基金项目镇江市社会发展资助项目 (SH 2004026) 作者简介顾红兵 (1971 - ) , 男, 主管技师, 在读硕士研究生, 从事临床生物化学检验。 下调相关基因, 增强化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作 用, 逆转
10、肿瘤细胞的多药耐药性 4。我们通过汗防 己素联合塞来昔布逆转白血病细胞耐药的相关研 究, 为多药联合逆转肿瘤细胞耐药机制的探讨奠定 基础。 1 材料与方法 1. 1 细胞系与培养条件 K562 细胞由本科保存, 接种于 10% 灭活小牛 血清的 RPMI 1640 培养液, 置于 37, 5% CO2培养 箱中, 2 3 d 传代一次。台盼蓝染色细胞活性在 95%以上。 1. 2 材 料 汗防己甲素由南京大学血液科提供, 柔红霉素 (Daunorubicin DNR) 为意大利 Famitalia 公司产品, 塞来昔布购于安徽合肥森瑞有限公司, RPMI 1640 购于 Gibco 公司, 小
11、牛血清购于杭州四季青公司, 凋 亡试剂盒购于 BD 公司, MTT 试剂购于华美生物工 程公司, COX-2 和 COX-1 引物由上海生工公司提 供。 1. 3 方 法 1. 3. 1 实验分组 实验时取对数生长期 K562 细 胞, 细胞密度按不同实验要求进行调整。对照组: 为 K562 细胞悬液; DNR 组: 为 K562 细胞悬液中 加入一定剂量的 DNR; DNR + TTD 组: 为 K562 细 胞悬液中加入一定剂量的 DNR 和 TTD; DNR + CELE 组: 为 K562 细胞悬液中加入一定剂量的 DNR 和 CELE; DNR + TTD + CELE 组: 为 K
12、562 细胞悬 液中加入一定剂量的 DNR, TTD 和 CELE。 1. 3. 2 汗防己甲素和塞来昔布的浓度选择 用 MTT 法测定不同浓度的 TTD 和 CELE 的细胞毒试 验。经灭菌处理的 96 孔细胞培养板, 加入对数生长 期的 K562 细胞 100 l, 终浓度为 5 105/ ml, 对照 孔加入等量的生理盐水, 每组三孔, 每个实验孔加入 不同浓度的 TTD, CELE 5 l, 对照组加入等量的生 理盐水, 震荡混匀, 置 37, 5% CO2饱和湿度的细 胞培养箱中培养 48 h。加入 12. 07 mmol/ L 的 MTT 磷酸盐缓冲液 10 l/ L, 继续培养
13、4 h, 加入终止液。 在酶标仪上用 570 nm 读出吸光度。以细胞抑制率 = (1 - 试验组 A 值/ 对照组 A 值) 100% 来判断 结果, IC5050% 时体外敏感, C50 50% 时体外耐 药。 1. 3. 3 MTT 法检测汗防己甲素联合塞来昔布对 K562 细胞的细胞毒试验 按实验分组, 在加入不同 浓度的 DNR 48 h, 加入 12. 07 mmol/ L 的 MTT 磷酸 盐缓冲液10 l/ L, 继续培养4 h, 加入终止液。测定 各组对 K562 细胞的抑制。 1. 3. 4 细胞内药物浓度的测定 按实验分组, 在加 入 0. 625 mol/ L DNR
14、后, 用对照组作为空白对照, 分别在 12 h, 24 h, 48 h 收集 2 105细胞在 490 nm 用 FMC 上测定 1 105的相对荧光强度, 细胞的相 对荧光强度与 DNR 的浓度成正比, 细胞内的药物浓 度, 在 Cell-Quest 软件下采用直方图进行统计。 1. 3. 5 磷脂酰结合蛋白 (AnnexinV) 检测早期凋亡 根据实验分组, 在加入 0. 625 mol/ L DNR 24 h 后收集 1. 2 106细胞, 用 4 预冷的 PBS 洗涤两 次, 用 1 ml blotbuffer 重悬细胞, 各加入 Annexin V- FITC 10 l, PI 20
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