淋巴细胞缺乏状态对白血病特异性细胞毒性T淋巴细胞体内抗白血病效应的影响.pdf
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1、中华血液学杂志2 0 0 5 年8 月第2 6 卷第8 期C h in J H e m a t o l , A u g u s t 2 0 0 5 , V o l 2 6 , N o . 8 论 著 淋巴细胞缺乏状态对白血病特异性细胞毒性 T 淋巴细胞体内抗白血病效应的影响 楼敬伟杨建民 陈莉贾 新颜章卫平王健民 【 摘要】 目 的 探讨淋巴细胞缺乏状态对白 血病特异性细胞毒性T 淋巴细胞( C T L ) 体内增殖和 抗白 血病作用的影响。方法 采用6 街 照射C 5 7 B L J 6 小鼠 诱导淋巴细胞缺乏状态, 分别经尾静脉注 射E G F P C 5 7 B L / 6 小鼠 脾T
2、淋巴 细胞和白 血病特异性C T L , 随后皮下接种1 x 1 护F B L 3 白 血病细胞。 用流式细胞仪分析小鼠外周血E G F P + 细胞及T 淋巴细胞亚群比例, 同时观察脾T 淋巴细胞和自血病 特异性C T L 对随后接种的F B L 3 白 血病细胞的杀伤作用。结果在淋巴细胞缺乏状态下输人的脾T 淋巴细胞和自 血病特异性C T L 均可得到有效扩增( 第1 8 天输注脾T 淋巴 细胞组和输注C T L 组外周血 中E G F P 十 细胞比 例分别为2 8 . 8 1 %和4 2 . 2 4 %) , 但脾T 淋巴细胞对随后接种的白血病细胞生长无抑 制作用, 而白血病特异性C
3、T L 在淋巴细胞缺乏受体小鼠体内扩增速度更快, 扩增的倍数更高, 并具有 显著增强的抗白血病作用。结论诱导受体淋巴细胞缺乏可显著增强外源性 C T L 输注的疗效。 【 关键词I 树突细胞; 免疫疗法: 淋巴细胞缺失; T 淋巴细胞, 细胞毒性 R e c i p i e n t l y m p h o p e n i a s t a t e e n h a n c e s t h e e x p a n s i o n a n d a n t i - l e u k e m i a e f f e c t o f l e u k e mi a s p e c i f i c c y t o
4、 - t o x i c T l y m p h o c y t e s L O U J i n g - w e i , Y A N G P a n - m i n , C H E N L i , J I A X i n - y a n , Z H A N G W e i - p i n g , W A N G J i a n - m i n . D e p a r t m e n t o f H e m a t o l o g y , C h a n g h a i H o s p i t a l o f S e c o n d M i l i t a r y M e d i c a l C
5、 o l l e g e , S h a n g h a i 2 0 0 4 3 3 , C h i n a C o r r e s p o n d i n g a u t h o r ; W A N G J i a n - m i n A b s t r a c t O b j e c t i v e T o d e t e r m i n e t h e r o l e o f r e c i p i e n t l y m p h o p e n i a s t a t e i n t h e e x p a n s i o n a n d f u n c t i o n o f l e
6、 u k e m i a s p e c i fi c c y t o t o x i c T l y m p h o c y t e s( C T L s ) . Me t h o d s C 5 7 B L / 6 m i c e w e r e i n d u c e d t o l y m p h o p e n i a w i t h 6 G y t o t a l b o d y i r r a d i a t i o n . S p l e e n T c e l l s o r l e u k e m i a s p e c ifi c T c e l l s f r o m
7、E G F P t r a n s - g e n i c C 5 7 B L / 6 - E G F P m i c e w e r e a d o p t i v e l y t r a n s f e r r e d b y i n t r a v e n o u s i n j e c t i o n . T h e m i c e w e r e c h a l l e n g e d s u b c u t a n e o u s l y w i t h 1 x 1 0 6 F B L 3 l e u k e m i c c e l l s a t d a y 2 a f t e
8、r i r r a d i a t io n . T h e p e r i p h e r a l W B C c o u n t , p e r - c e n t a g e o f E G F P c e l l s , s u b s e t s o f T c e l l s a n d t u m o r s i z e s w e r e m o n i t o r e d . R e s u l t B o t h o f t h e s p l e e n T c e l l a n d l e u k e m i a s p e c i f i c C T L p r o
9、 l i f e r a t e d e f f i c i e n t l y w i t h t h e p e n c e n t a g e o f E G F P c e l l s o f 2 8 . 8 1 % a n d 4 2 . 2 4 %, r e s p e c t i v e l y , a f t e r i n f u s e d i n t o l y m p h o p e n i c r e c i p i e n t s . H o w e v e r , s p l e e n T c e l l s h a d n o a n t i - l e u
10、k e - m i a e f f e c t r e g a r d l e s s o f i t s e x p a n s i o n . I n c o n t r a s t , l e u k e m i a s p e c i f i c C T L s s h o w e d a m o r e r a p i d a n d e x t e n s i v e e x p a n s i o n u n d e r t h e c o n d i t i o n o f l y m p h o p e n i a a n d a e n h a n c e d a n t
11、i - l e u k e m i a i m m u n i t y . C o n c l u s i o n T r a n s f u - s i o n o f l e u k e m i a s p e c i fi c C T L s u n d e r l y m p h o p e n i a s t a t e c o u l d b e a f e a s i b l e s t r a t e g y t o e x p a n d l e u k e m i a s p e c i f - i c C T L s a n d g e n e r a t e f a v
12、 o r a b l e a n t i - l e u k e m i a e f f e c t i n v i v o . K e y w o r d s I D e n d r i t i c c e l l ; I m m u n o t h e r a p y ; L y m p h o c y t e d e p l e t i o n ; T - l y m p h o c y t e s , c y t o t o x i c 目 前对肿瘤的细胞免疫治疗的研究多集中在对 肿瘤抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞( C T L ) 的诱导 和体外扩增方面, 包括细胞因子和共刺激分子基因
13、 与抗原基因联合转导的免疫基因治疗、 采用不同细 胞因子和免疫分子的单克隆抗体提高 C T L体外扩 增效率以及次要组织相容性抗原特异性C T L T 细胞 受体( T C R ) 的 克隆 等 , 而对肿瘤细胞特异性C T L 在体内增殖的动力学参数、 发挥细胞毒作用的条件 及其优化方法等影响细胞免疫治疗疗效的关键因 素 则 较少涉及。 我们采用诱导宿主淋巴细胞缺 乏状态联合白血病特异性 C T L 输注, 显著改善了白 血病特异性C T L 的抗白 血病作用, 为改善细胞免疫 治疗的临床疗效提供了新的思路。 材料和方法 基金项目: 国家“ 8 6 3 ” 计划资助项目 ( 2 0 0 2
14、A A 2 0 5 0 5 1 0 ) 作者单位: 2 0 0 4 3 3 上海, 第二军医大学长海医院血液科 通信作者: 王健民, E - m a i l ; j m w a n g m e d m a i l . c o m . c n 1 主要材料小鼠红白血病 F B L 3细胞株由第二 军医大学免疫教研室惠赠。C 5 7 B L / 6 小鼠购自中国 中华血液学杂志2 0 0 5 年8 月第2 6 8 期C h i n J H e m a t o l , A u g u s t 2 0 0 5 . V o l 2 6 , N o . 8 科学院上海实验动物中心; C 5 7 B L /
15、 6 - E G F P 小鼠为 转增强型绿色荧光蛋白( E G F P ) 基因的C 5 7 B L / 6 小 鼠, 其所有细胞均表达增强的绿色荧光, 由 第二军医 大学细胞生物学教研室提供。R P M I 1 6 4 0 培养基为 美国G i b c o 公司产品, 新生牛血清为杭州四季青生 物工程材料有限公司产品( 5 6灭活3 0 m i n ) 。完 全培养液用 R P M 1 1 6 4 0 十 1 0 %新生牛血清配制。细 胞因子G M - C S F 购自 美国R & D 公司, I L - 4 购自P e p - r o t e c h公司。P E或 F I X 标记的抗
16、鼠 C D 3 , C D 4 , C D 8 抗体购自S c i e n c e t e c h 公司。 2 研究方法 2 . 1 骨髓单个核细胞来源树突细胞( D C ) 的培养: 取4 - 6 周龄雌性 C 5 7 B L / 6小鼠, 颈椎脱臼法处死 后常规分离股骨和胫骨, 用完全培养液制备密度为 1 x 1 0 6 / m l 骨髓单个核细胞悬液, 分别加人5 n 留 m l 和2 n g / m l 的重组鼠G M - C S F 和I L 1 1 , 充分混匀后按 每孔3 m l 加至6 孔板中, 置3 7 - C , 5 %C O : 培养箱中 在饱和湿度条件下培养, 隔日 半
17、量换液, 第7 天换液 时将G M - C S F 因子浓度减至2 n 留m l , 第9 天收获培 养板中的悬浮D C 备用。 2 . 2 肿瘤细胞冻融产物的制备: 取处于对数生长 期的F B L 3细胞悬液4 0 m l , 调整细胞密度至 1 x 1 0 / m l , 置4 2 水浴热休克处理I h 后将细胞悬液 移至多个2 m l 冻存管中, 液氮、 3 7 水浴各1 5 m i n , 经6 个循环反复冻融, 用孔径为0 . 2 2 R m滤器滤过 后备用。 2 . 3 白血病抗原的负载: 收集培养第8 天的D C , 按 肿瘤细胞冻融产物与 D C比例为5 : 1 加人经热休 克
18、处理的F B ”冻融产物( F B L 3 - H S ) , 置3 7, 5 % C O : 培养箱中培养8 h 后收集D C , 1 5 0 0 r / m i n 离心 1 0 m i n 后弃去上清, 用无菌P B S 冲洗2 次备用。 2 . 4 E G F P + 脾T淋巴细胞的制备: 颈椎脱臼法处 死C 5 7 B L / 6 小鼠, 常规灭菌后无菌分离脾脏、 制备 脾 单 个 核细 胞, 在 完 全 培 养 液中 置3 7 9C , 5 % C 0 2 培 养箱中培养9 0 m i n , 轻柔地吸取非贴壁细胞, 调至4 x 1 0 / m l 。 取0 . 5 m l 加至经
19、5 m l 3 7 预热的完全 培养液预先冲洗的尼龙毛柱中, 随后加人0 . 2 m l 的 完全培养液, 置3 7 C , 5 % C 0 2 、 饱和湿度培养箱中 孵育1 h 后, 用3 7预热的完全培养液缓慢洗脱, 收集洗脱的细胞, 1 5 0 0 r / m i n 离心1 0 m i n 后弃去上 清, 用完全培养液洗涤1 次后作为脾T 淋巴细胞备 用, 用锥虫蓝染色后计数并测定细胞的活性, 用流式 细胞仪检测其C D 3 , C D 8 + 和C D 4 + 细胞比例。 2 . 5 F B L 3 特异性 C T L 的体外扩增: 取上述经尼龙 毛柱纯化的E G F P 十 脾T
20、淋巴细胞, 配成1 x 1 0 6 / m l 的细胞悬液, 按D C与T 细胞的比例1 : 1 0 加人经 F B L 3 - H S 冲击的D C ( 3 0 份 照射后) , 以每孔3 m l 接 种于6 孔板中, 每日 观察细胞形态的变化, 至培养液 变为橙红色时半量换液, 第 7天用相同数量的 F B L 3 - H S 重复冲击 1 次, 在第 1 0天加人 1 0 0 U / m l 的I L - 2 , 在培养第 1 4天用流式细胞仪检测 T细胞 C D 3 , C D 8 + 和C D 4 十 细胞比 率, 并用乳酸脱氢酶释 放法检测其对白 血病细胞的细胞毒性作用。 2 .
21、6 小鼠淋巴细胞缺乏状态的诱导: 取6 一 8 周龄 雌性 C 5 7 B L / 6小鼠1 2只, 按每组4只随机分成3 组。在1 8恒温清洁级动物饲养室中适应5d 后 用 60 c 。 进行全身照射, 照射剂量分别为2 , 4 , 6 G y ( 照射距离1 2 3 c m , 剂量率1 8 . 6 5 c G y / m i n , 照射时 间分别为6 4 3 , 1 2 8 7 和1 9 3 0 s ) , 从照射前1 d 开始 隔日 监测小鼠血常规变化。 2 . 7 白血病特异性 C T L的体内杀伤效应: 取6一 8 周龄的雌性 C 5 7 B L / 6 小鼠2 0只, 按每组5
22、只随机 分成4 组, 对其进行6 脚 全身照射并在照射后第1 天和第3 天分别经尾静脉注射1 x 1 0 7 ( 0 . 3 m l ) C 5 7 B L / 6 - E G F P白血病特异性C T L 或小鼠脾T 淋巴 细胞, 设单次注射C T L 和不注射C T L 空白对照。于 照射后第2 天在小鼠右背中部近腹侧经皮下注射处 于对数生长期的F B ”细胞1 x 1 0 6 ( 0 . 3 m l ) 。 每2 d 用游标卡尺测量并记录瘤块大小, 按长径 x 短径 x 厚径计算瘤块体积, 每6d观察小鼠的体重和血 常规变化, 如小鼠在实验过程中死亡, 记录其具体的 死亡时间( d )
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- 关 键 词:
- 淋巴细胞 缺乏 状态 白血病 特异性 细胞 毒性 体内 效应 影响
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