瑞香素对恶性疟原虫细胞色素C氧化酶及核糖核酸还原酶活性的影响.pdf
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1、中国 寄 生虫学与寄生 虫病杂 志2 0 0 6 年6 月第2 4 卷第3 期C h i n J P a r a s it o l P a r a s i t D i s J u n e 2 0 0 6 , V o l . 2 4 , N o .3 1 7 9 文章编号: 1 0 0 0 - 7 4 2 3 ( 2 0 0 6 ) - 0 3 - 0 1 7 9 - 0 4【 论著】 瑞香素对恶性疟原虫细胞色素C氧化酶 及核糖核酸还原酶活性的影响 黄芳 ,汤林华 ,陈博2 , 倪奕昌 , 王琴美 摘要】 目的 体外测定瑞香素对恶性疟原虫细胞色素C氧化酶( C O X ) 及核糖核酸还原酶( R
2、 N R ) 活性的影响。 方法 T r a g e r 在瑞香素浓度为0 . 1 , 1 , 1 0 0 和1 0 0 0 p m o l / L , 作用6 h 后, C O X活性分别被抑制 3 %, 3 1 %, 5 3 % 和8 4 %; 而瑞香素一 F e 复合物对C O X的影响几乎消失。经瑞香素( 1 0 0 L m o l / L ) 作用1 , 2 , 3 和4 h 后 R N R 活性分别被抑制7 %, 5 1 %, 6 9 % 和7 5 %; 在瑞香素浓度为0 . 1 、1 、1 0 0 和1 0 0 0 R m o l / L , 作用6 h 后, R N R活性 分
3、别被抑制3 % a , 3 1 %, 5 8 %和9 3 %;而瑞香素一 F e 复合物作用6 h 后R N R活性分别被抑制8 %, 6 %, 1 1 %和9 %0 结论 在体外瑞香素可显著降低恶性疟原虫的细胞色素C 氧化酶( C O X ) 及核糖核酸还原酶( R N R ) 活性。 【 关键词】 瑞香素; 恶性疟原虫; 细胞色素C 氧化酶; 核糖核酸还原酶 中图分类号: R 3 8 2 . 3 1 2文献标识码: A I n V i t r o E f f e c t o f D a p h n e t i n Ri b o n u c l e o t i d e Re d u c t
4、a s e o n C y t o c h r o m e o f P l a s mo d i u m C Ox i d a s e a n d f a l c ip a r u m H U A N G F a n g , T A N G L i n - h u a , C H E N B o g , N I Y i - c h a n g , WA N G Q t o- m ei ( 1 N a t i o n a l I n s t i t u t e o f P a r a s i t i c D i s e a s e s , C h i n e s e C e n t e r f
5、o r D i s e a s e C o l la b o r a t i n g C e n t r e f o r M a la r i a , S c h i s t o s o m i a s i s a n d F i l a r i a s 奴 S h a n g h a i G e n e t i c s , F u d a n U n i v e r s 奴 S h a n g h a i 2 0 0 4 3 3 , C h i n a ) A b s t r a c t O b j e c t i v e T o t e s t t h e i n v it r o e f
6、 f e c t o f d a p h n e t i n o n C o n t r o l a n d P r e v e n t i o n , W H O 2 0 0 0 2 5 , C h i n a ; 2 D e p a r t m e n t o f c y t o c h r o m e C o x i d a s e ( C O X ) a n d r i b o n u c l e o t i d e r e d u c t a s e ( R N R ) a c t i v i t y o f P l a s m o d i u m f a l c ip a r u
7、m . Me t h o d s P . f a l c ip a r u m ( F C C I / H N ) w a s c u l t u r e d i n v i t r o u s i n g t h e m e t h o d o f T r a g e r a n d J e n s e n . T h e e ff e c t o f d a p h n e t i n a n d d a p h n e t i n - F e c o m p l e x o n C O X a n d R N R a c t i v i t y o f P f a l c ip a r
8、u m w a s t e s t e d b y u l t r a v i o l e t s p e c t r o p h o t o m e t e r a n d e l e c t r o n s p i n r e s o n a n c e ( E S R ) r e s p e c t i v e l y . R e s u l t T h e p a r a s i t e s s y n c h r o n i z e d w i t h s o r b i t o l i n v i t r o w a s t r e a t e d b y d a p h n e
9、t i n a n d d a p h n e t i n - F e c o m p l e x . T h e i n h i b i t io n l e v e l o f t h e C O X a c t i v i t y b y d a p h n e t i n a f t e r b e i n g tr e a t e d f o r 2 , 4 , 8 a n d 1 2 h w e r e 0 .6 % , 7 3 % a n d 8 0 0! o r e s p e c t i v e l y a n d t h e i n h i b i t i o n l e
10、v e l b y d a p h n e t i n a t d i ff e r e n t c o n c e n t r a t i o n s ( 0 . 1 ,I ,1 0 0 a n d l m m o l/ L ) f o r 6 h w a s 3 %, 3 1 %, 5 3 % a n d 8 4 %, r e s p e c t i v e l y . N o c o n s i d e r a b l e e ff e c t w a s o b s e r v e d o n t h e C O X a c t i v i t y o f P f a l c ip a
11、 r u m t r e a t e d w i t h d a p h n e t i n - F e c o m p l e x . T h e t y r o s y l f r e e r a d i c a l w a s t e s t e d t o r e fl e c t t h e R N R a c t i v it y o f 只 f a l c ip a r u m a t v a r i o u s t i m e s b y E S R . T h e i n h i b i t i o n l e v e l b y d a p h n e t i n f o
12、r 1 ,2 , 3 a n d 4 h w e r e 7 %,5 1 %,6 9 % a n d 7 5 % r e s p e c t i v e l y , w h i l e t h e v a l u e s t r e a t e d b y d a p h n e t i n - F e c o m p l e x w e r e 8 %, 6 %, 1 1 % a n d 9 % r e s p e c t i v e l y . T h e i n h i b i t i o n l e v e l b y d a p h n e t i n a t d i ff e r
13、e n t c o n c e n t r a t i o n s ( 0 . 1 ,1 ,1 0 0 a n d 1 m m o l / L ) f o r 6 h w a s 3 %,3 1 %,5 8 % a n d 9 3 % r e s p e c t i v e l y a n d w h i l e t h e v a l u e s t r e a t e d b y d a p h n e t i n - F e c o m p l e x w e r e 8 %, 6 %, a n d R N R a c t i v i t i e s o f P l a s m o d
14、i u m f a l c ip a r u m i n 1 1 % a n d 9 %. vi t r o . D a p h n e t i n s i g n i f i c a n t l y r e d u c e s t h e C O X K e y w o r d s D a p h n e t in ; P la s m o d i u m f a lc ip a r u m; C y t o c h r o m e C o x id a s e ( C O X ) ;R ib o n u c le o t id e r e d u c t a s e ( R N R ) C
15、 o r re s p o n d i n g a u t h o r , E - m a i l : i p d t l h s h 1 6 3 .n e t 作者单位:1中国疾病预防 控制中 心寄生虫病预防控制所, 世界卫生组织疟疾、 血吸虫病和丝虫病合作中 心, 上海 2 0 0 0 2 5 ; 2复旦大学生命科学学院遗传系, 上海 2 0 0 4 3 3 通讯作者, E - m a i l : i p d t l h s h 1 6 3 .n e t 1 8 0中国寄生虫学与寄生虫病杂志2 0 0 6 年6 月第2 4 卷第3 期C h i n J P a r a s i t o l
16、P a r a s i t D i s J u n e 2 0 0 6 , V o l . 2 4 , N o .3 疟疾是一种全球性危害人类健康的重要寄生虫 病。据统计,全球约有4 0 %的人口遭受疟疾威胁, 每年临床病例数为2 .5 - 3 亿, 其中死亡人数为1 5 0 - - - 2 7 0 万 。研制新型抗疟药对于防治疟疾具有重要的 意义。铁赘合剂作为一种新型的抗疟化合物, 其抗疟 作用已得到验证。瑞香素是一种中草药提取物, 属于 弱铁鳌合剂。目 前研究发现, 1 -1 0 li m o l / L 瑞香素体 外试验对恶性疟原虫的杀裂殖体活性与同剂量的氯喳 相似, 而 在感染伯氏 疟
17、原虫 ( A N K I 株)的 小鼠中 瑞 香素灌胃或腹腔注射均与氯哇灌胃有相似的抗疟效 果, 瑞香素抗疟作用与其铁赘合能力有密切关系t2 -4 1 0 为进一步了解瑞香素的抗疟机制,寻找瑞香素抗疟 作用的分子靶标,本文探讨瑞香素在体外对恶性疟 原虫细胞色素C氧化酶 ( C O X )及核糖核酸还原酶 ( R N R )活性的影响。 4 9 C 1 0 0 0 0 x g 离心2 0 m i n , 上清液为恶性疟原虫总蛋 白裂解液。 4 测定C o x的活性 在培养基中分别加人0 . 1 , 1 、1 0 0 和1 m m o l/ L 的 瑞香素及瑞香素一 F e 复合物,每个剂量组设3
18、 个平行 对照, 在自 动恒温培养箱 ( 3 3 6 6 S / N 3 3 3 7 8 - 4 0 7 , 日 本)中培养6 h , 分别测定C O X的活性。此外, 在培 养基中加人1 0 0 L m o l / L 的瑞香素, 分别在自 动恒温 培养箱中 培养2 , 4 , 8 和1 2 h 后, 用紫外分光光度仪 ( D U 6 5 0 , 德国B e c k m a n 公司) 测定吸光度 扭s , 值) , 得到各样品的C O X活性值 ( U / m l ) o 材料与方法 1 药物 瑞香素( 批号: 0 5 0 2 0 2 0 4 ) 吉林西点制药厂生产, 细胞色素C 氧化酶试
19、剂盒购自 美国S i g m a 公司, 硫酸 亚铁铰 ( F A S )购自 上海化学试剂公司。按参考文献 5 方法制备瑞香素一 F e 复合物。 2 恶性疟原虫的培养 按文献 6 方法建立恶性疟原虫 ( F C C 1 / H N 株) 体外培养体系。疟原虫的完全培养基为含2 5 m m o l / L 二经乙基呱嗦乙烷磺酸 ( H E P E S ) , 2 3 .8 m m o l / L N a H C 0 3 , 5 0 m g / L庆大霉素及1 0 % 兔血清 ( 上海复 旦悦达生物科技公司)的R P M 1 1 6 4 0( 美国G i b c o 公 司) 。0型红细胞 (
20、 购自 上海血液中心)用完全培养 基稀释至红细胞比容为5 %,培养条件为3 7 c C , 5 % C O , 5 % O Z 及9 0 % N Z , 生长稳定后, 参照文献 7 用5 % 甘露醇进行同步化处理, 一个裂殖体增殖周期 后 ( 约4 8 h )再次用5 % 甘露醇处理,同步化后继续 培养至成熟裂殖体期。以镜检法调整最终的红细胞比 容为5 %, 原虫血症为3 %0 5 测定R N R的活性 参照文献 8 用电子自 旋共振 ( e l e c t r o n s p i n r e v o l v e , E S R )法 ( E R 2 0 0 D - S R C ,德国B r
21、u k e : 公 司)分别测定瑞香素与瑞香素一 F e 复合物在不同时间 和不同 浓度时恶性疟原虫R N R 上B : 蛋白中T y r 自由 基的量来反映R N R的活性9 。在培养基中分别加人 0 . 1 、 1 、 1 0 0 和1 0 0 0 V L m o l / L 的 瑞香素及瑞香素 一 F e 复 合物, 在自 动恒温培养箱中培养6 h测定R N R的活 性; 此外在培养基中 加人1 0 0 li m o l/ L 的瑞香素在自 动恒温培养箱中培养1 , 2 , 3 和4 h 后分别测定介r 自由基的量。 结果 1 C O X的活性 经瑞香素 ( 1 0 0 ji m o l
22、/ L )和瑞香素一 F e 复合物作 用2 , 4 , 8 和1 2 h 后恶性疟原虫C O X活性分别被 抑制了。 、6 %, 7 3 %和8 0 %,而且作用5 h 后C O X 活性开始明显降低,至l l h 达到最低点 ( 图1 ) ( n = 0 . 0 4 6 0 . 0 3 5 0 . 0 3 0 0 . 0 2 5 0 . 0 2 0 0 . 0 1 5 0 . 0 1 0 0 . 0 0 5 0 李 火 石 一 I 一 - k 一 4 一 玉 一 玉 乍之冲XO口飞扮卜祠。V 划牌只0口 3 恶性疟原虫总蛋白的提取 将培养箱中的培养物1 O O O x g 离心5 m i
23、n , 去上 清,加人 1 0 倍体积的0 .0 1 5 % 皂素溶液,3 7 O C 孵育 1 5 m i n , 不停搅拌, 3 O O O x g 离心1 0 m i n 后, 所得疟 原虫再以H a n k s 液 ( 含0 .1 4 g C a C 1 2 , 0 .4 g K C l , 0 .0 6 g K H 2 P 0 4 , 0 - 1 0 9 M g C 1 2 . 6 H 2 0 , 0 - 1 0 9 M g S 0 4 - 7 H 2 0 , 8 .O g N a C I , 0 .3 5 g N a H C 0 3 、 0 .0 9 8 N a 2 H P 0 4
24、 . 7 H 2 0 , 1 .0 g D - 葡 萄 糖, 1 m l 0 . 1 % 酚 红) 洗3 次, 超声 波匀浆破碎疟原虫, 0 24 6 1 0 1 2 ( h ) 1 4 1 6 时间T i m e 一瑞香素D a p h n e t i n 一 瑞 香 素 一 F e 复 合 物D a p h n e t i n - F e c o m p l e x 图1 瑞香素和瑞香素. F e 复合物不同作用时间对恶性疟 原虫C o x 活性的影响 F i g . 1 C y t o c h r o m e C d a p h n e t i n a n d o x i d a s e
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