碘化N-正丁基氟哌啶醇对大鼠心室肌细胞L型钙通道的阻断作用.pdf
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1、碘化 N-正丁基氟哌啶醇对大鼠心室肌 细胞 L 型钙通道的阻断作用 黄展勤, 石刚刚, 郑锦鸿, 高分飞, 张艳美, 周燕琼, 刘幸平 (汕头大学医学院药物研究室, 广东 汕头 515031) 收稿日期: 2006 -02 -14, 修回日期: 2006 -04 -06 基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (No 30070304) ,国家新药研 究基金资助项目 (No 9690105231) , 广东省科技计划项目 (No C30104)和广东省自然科学基金重点项目 ( No 621235) 作者简介: 黄展勤 (1974 - ) , 男, 博士, 助理研究员, Tel:0754- 890
2、0430;Fax: 0754-8557562, E-mail:zqhuang stu. edu. cn; 石刚刚 (1957 - ) , 男, 博士, 教授, 博士生导师, 研究方 向: 心血管药理及药物开发 中国图书分类号: R-332; R 322. 11; R 329. 25; R 348. 1; R 971. 41; R 972 文献标识码: A 文章编号: 1001 -1978 (2006) 06 -0702 -04 摘要: 目的 研究碘化 N-正丁基氟哌啶醇 (F2) 对大鼠心室 肌细胞 L-型钙通道 (ICa) 的影响。方法 采用酶急性分离的 单个大鼠心室肌细胞, 应用膜片钳全细
3、胞记录技术, 观察 F2 对 ICa的影响。结果 F20. 1,1, 10 10 -6 molL -1可剂量 依赖地抑制 ICa, 抑制率分别为 40%, 72%, 84%, IC50为 1. 19 10 -6 molL -1。F 2上移 ICa的 I-V 曲线, 但不改变 ICa的最 大锋电位和翻转电位; F2对 ICa稳态激活曲线无明显改变; F2 可使得 ICa稳态失活曲线左移; 延长 ICa失活恢复时间。结论 F2对心肌细胞 ICa具有阻断作用。 关键词: 钙通道; 膜片钳; 心肌细胞 碘化 N-正丁基氟哌啶醇 (N-n-butyl haloperidol iodide,以下简称 F2
4、) 是我们在对临床上常用的抗精 神病药物氟哌啶醇的系列研究中, 发现其具有心血 管活性的基础上 1 5进行结构改造, 制得了一种结 构全新的氟哌啶醇季铵盐衍生物 (国家发明专利号 ZL96119098. 1; 公开号 CN1149581A; 分子式见 Fig 1) 。F2因增大了极性, 故不易透过血脑屏障, 从而 避免了中枢锥体外系的不良反应, 而又具有外周扩 张血管及抗心肌缺血的作用。我们对 F2药效学的 系列研究表明 F2具有良好的心血管的活性, 在离体 条件下, 可以扩张冠状动脉 6, 拮抗 KCL 诱导的猪 冠脉螺旋条收缩的效应 7; 在整体条件下, 对抗血 管升压素所致大鼠心电图的缺
5、血改变 8;F 2 对大 鼠和家兔心肌缺血/ 再灌注损伤具有保护作用 9, 10。 基于 F2以上的结果, 我们认为 F2扩张血管及抗心 肌缺血的机制可能是 F2作为钙通道阻滞剂在发挥 作用, 本文采用酶急性分离的单个大鼠心室肌细胞, 应用膜片钳全细胞记录技术, 研究 F2对 L 型钙通道 的作用。 Fig 1 Chemical structure of N-n-butyl haloperidol iodide(F2) 1 材料与方法 1. 1 动物 SD 大鼠, (各半, 体质量 (235 15) g, 由汕头大学医学院动物中心提供。 1. 2 药品与试剂 F2, 由汕头大学医学院药物研究
6、室合成, 结构由中国科学院上海有机化学所鉴定; verapamil 由德国基诺药厂生产; Collagenase P 为 Roche Diagnostics 产 品;Taurine、EGTA、TEA、 4- aminopyridine、 HEPES 、 CsOH、CsCl, 、 TTX 均为 Sig- ma 公司产品。 1. 3 单个大鼠心室肌细胞的制备 11 SD 大鼠, 断 头, 颈动脉放血, 迅速取下心脏, 在 4 无钙液 (成 分: NaCl 135, KCl 5. 4 , MgCl21. 0 , NaH2PO40. 33, glucose 10,HEPES 10 mmolL -1,
7、pH 7. 4) 中去除 脂肪及心包膜, 经主动脉进行 Langendorff 灌流。用 无钙液经主动脉逆行灌流约 6 min, 再用酶溶液 (成 分: Collagenase P 0. 12 gL -1;Taurine 20;CaCl 2 0. 075, NaCl 135 ,KCl 5. 4 ,MgCl21. 0,NaH2PO4 0. 33,glucose 10,and HEPES 10 mmolL -1, pH 7. 4) 50 ml 反复灌流约 20 min, 直至心脏变得柔软、 松弛。整个灌流过程中压力维持在 70 cm H2O, 37恒温, 持续通 950 gL -1O 2 和 50
8、 gL -1 CO2 混合气。剪下心室肌, 在 KB 液 (成分: KOH 85,L- glutamic acid 50,KCl 30,KH2PO430,taurine 20, MgCl21. 0,HEPES 10,EGTA 1 glucose 10 mmol L -1) 中轻柔吹打, 直至大量细胞分离下来, 用 200 目筛网过滤, 得到细胞混悬液, 贮存于 KB 液之中。 207中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2006 Jun; 22 (6) : 702 5 1. 4 全细胞记录 12 选取杆状, 横纹清楚、 胞膜完 整的心肌细胞, 调节微
9、操纵器, 形成一定的封接, 给 予负压吸引, 可形成阻值为 1. 0 10 G 的高阻抗 封接; 再给予快速负压吸引或电刺激, 细胞膜破裂, 形成全细胞记录状态。记录的细胞外液成分: TTX 0. 002,TEA-Cl 140,CaCl21. 8,MgCl21. 0,glucose 10,and HEPES 10 mmolL -1, 电极内液的成分: CsCl 150;MgCl21. 0;HEPES 5. 0;EGTA 5. 0; ATP- Mg 3. 0 mmolL -1。全细胞记录过程中, 应用的 pClamp 8. 1 软件、 Axon200B 膜片钳放大器及 AD/ DA 转换器 (D
10、igidata1322A) 均为美国 Axon 公司产 品。 1. 5 资料分析及数据处理 记录的电流在 pClamp 8. 1clampex 和 clampfit 程序中进行分析和电流大小 的测量, 实验结果用%x s 表示, 采用方差分析法处 理。稳态失活曲线和稳态激活曲线用 Boltzmann 方 程拟合, IC50采用 SigmaPlot 7. 0 统计软件求得。 2 结果 2. 1 F2对大鼠心室肌细胞 ICa及其电压 - 电流关 系曲线 (I-V) 的影响 在保持电压 (holding poten- tial) 为 -40 mV, 去极化电位 (depolarizing poten
11、tial) 由 -40 mV 至 +60 mV, 梯度 (step) 10 mV, 刺激波宽 (Duration) 为 300 ms 的刺激参数下, 记录到内向电 流, 此电流具有电压和时间依赖性, 最大激活电位为 0 mV, 反转电位为 +50 mV。1 10 -6molL-1 Ver- apamil 可抑制此内向电流, 证明该电流为 ICa。同样 刺激条件下, F20. 1,1,10 10 -6molL-1可剂量 依赖的抑制 ICa, 抑制率分别为 40%, 72%, 84% , 电 流锋值分别从 (1895 462)pA,(1791 382)pA, (1834 443)pA 降低至 (1
12、137 345)pA, (501 109)pA, (293 117)pA(P 0. 05, n = 5 cells) , s 分别为 4. 3 0. 7 和 5. 9 1. 3(P 0. 05, n =5 cells) , F2对 ICa稳态激活曲线无影响 (Fig 4) 。 采用双脉冲刺激法观察 F2对 ICa稳态失活过程的影 响, 保持电位为 -40 mV, 条件脉冲从 -80 mV 开始 逐步去极化至 30 mV, 持续 1 s, 测试脉冲为 0 mV, 持续 300 ms。依 Boltzmann 方程 I/ Imax=1/ 1 + exp (V - V1/2) / s) 进行曲线拟合,
13、 得到稳态失活曲 线, 以及半数失活电位 V1/2和斜率因子 s。F2(1 10 -6molL-1) 作用前后 V 1/2分别为 ( -19. 3 3. 5) mV 和 ( - 31. 9 2. 7)mV (P 0. 05, n = 5 cells) 。F2作用下使得 ICa稳态失活曲线左移, 即向 超极化方向移动 (Fig 4) 。 2.3 F2对 L 型钙通道失活后恢复动力学的影响 采用双脉冲刺激法, 保持电位为 -40 mV, 给予去极 化至 0 mV 的刺激, 持续 1 s,回到保持电位持续 50 ms 后, 再给予去极化至 0 mV, 持续 300 ms, 前后两 个脉冲的间隔时间逐
14、渐增加。给药前后得到的曲线 用指数方程 I% = A + B exp ( - t/ )拟合 (I%为第 二脉冲电流与第一脉冲电流的比值, t 为两脉冲之 间的间隔时间, 为灭活后再激活的时间常数) 。给 药前后 (F21 10 -6molL-1) 的 值分别为 (82 28)ms 和 (134 32)ms (P 0. 05, n =5 cells) . It suggested that F2had no effects on the activa- tion curve of ICaThe steady-state inactivation curve (f)of ICawas ob- ta
15、ined by using twin-pulse protocol. Membrane potential is first stepped from -80 mV to 30 mV for 1 s (prepulse)and then to 0 mV for 300 ms (test pulse) . Plots of the peak current of the test pulse as a function of prepulse potential in absence (+)and presence(,) of 1 10 -6mol L -1F 2. Smooth lines r
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