禽源鹦鹉热衣原体MOMP基因重组腺病毒载体的构建与鉴定.pdf
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1、中图分类号:S8 5 2. 6 7:Q7 8 6 文献标识码:A 文章编号:1 6 7 3 - 4 6 9 6(2 0 0 6)0 1 - 0 0 1 3 - 0 5 禽源鹦鹉热衣原体 SSP基因重组腺病毒 载体的构建与鉴定 周继章1,邱昌庆1,张小英2,曹小安1 ( 1.中国农业科学院 兰州兽医研究所,甘肃 兰州 7 3 0 0 4 6;2.兰州市动物检疫站,甘肃 兰州 7 3 0 0 5 0) 摘要:对从疑似禽衣原体病鸡分离鉴定的鹦鹉热衣原体用P C R方法扩增, 获得了完整的外膜 主蛋白(MOMP) 基因, 将其克隆到p MD1 8 - TS i m p l e载体中, 用B g l和S
2、 a l双酶切出目的基 因, 并将其与已线性化的p s h u t t l e - CMV穿梭载体连接。然后, 将阳性质粒转化入含有腺病毒骨架 载体的B J 5 1 8 3感受态细胞中进行同源重组。将同源重组的腺病毒粒子转入DH 5 大肠埃希氏菌 增殖。提取同源重组后的腺病毒粒子转染A D - 2 9 3细胞, 待重组腺病毒在A D - 2 9 3细胞中传代稳定 后, 经P C R技术检测, 扩增到了MOMP目的基因;用间接免疫荧光试验检测, 呈阳性反应, 证明目 的蛋白得到了表达。经测定, 重组腺病毒的效价达3. 91 0 1 0P F U /m L。 关键词:鹦鹉热衣原体;MOMP基因;腺
3、病毒载体;表达 C o n s t r u c t i o na n d i d e n t i f i c a t i o no f r e c o m b i n a n t a d e n o U i r u sw i t hSSP g e n eo fC h l a y d i ap s i t t a c io fa U i a no r i g i n Z HOUJ i - z h a n g 1, Q I UC h a n g - i i n g 1, Z HANGX i a o - y i n g 2, C AOX i a o - a n 1 (1.L a n z h o uV
4、 e t e r i n a r yR e s e a r c hI n s t i t u t e,C h i n e s eA c a d e m yo fA g r i c u l t u r a lS c i e n c e s,L a n z h o u7 3 0 0 4 6,C h i n a; 2.L a n z h o uA n i m a lQ u a r a n t i n eS t a t i o n,L a n z h o u7 3 0 0 5 0,C h i n a) A b s t r a c t:Ac o m p l e t e MOMPg e n ew a sa
5、 m p l i f i e df r o mC h l a m y d i ap s i t t a c io fc h i c k e n sw i t ha v i a n c h l a m y d i o s i sb yP C R,a n dt h ea m p l i c o nw a sc l o n e dc o r r e c t l y i n t oap MD1 8 - TS i m p l ev e c t o r . T h eMOMP g e n ed i g e s t e df r o mt h ep MD1 8 - TS i m p l ev e c t o
6、 rb yB g la n dS a l w a s l i n k e dw i t ha l i n e a r i z e dp s h u t t l e - CMVv e c t o r t oo b t a i nl i n e a r i z e dp o s i t i v ep l a s m i d s . T h e l i n e a r i z e dp o s i t i v ep l a s m i d sw e r e t r a n s f o r m e d i n t o B J 5 1 8 3c o m p e t e n tc e l l sc o n
7、 t a i n i n gaa d e n o v i r u sf r a m e w o r kv e c t o rf o rh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o na n dt h e r e s u l t a n t r e c o m b i n a n t sw e r e t r a n s f o r m e d i n t oDH 5c e l l s f o r f u r t h e r r e p l i c a t i o n. T h e r e c o m b i n e da d e n o v i - r
8、u sp a r t i c l e sc o n t a i n i n gt h eMOMPg e n ew e r ee x t r a c t e da n du s e dt ot r a n s f e c tA D - 2 9 3c e l l s .Wh e nt h er e - c o m b i n a n t a d e n o v i r u sb e c a m ea d a p t a b l e t oA D - 2 9 3c e l l s f o l l o w i n gc o n t i n u o u sp a s s a g e s,t h e t
9、a r g e tg e n ew a s d e t e c t e db yP C Ra n d t h e e x p r e s s e dp r o d u c tw a sd e t e c t e db y i n d i r e c t i mm u n o f l u o r e s c e n c e t e s t . T i t e r so f t h e r e c o m b i n a n ta d e n o v i r u sw a s3. 91 0 1 0P F U /m L. K e yw o r d s:C h l a m y d i ap s i t
10、 t a c i;MOMPg e n e;a d e n o v i r u sv e c t o r;e x p r e s s i o n 禽衣原体病(a v i a nc h l a m y d i o s i s) 是由鹦鹉热衣 原体( C h l a m y d i ap s i t t a c i) 感染禽类引起的一种接 触性传染病, 又称鹦鹉热( p s i t t a c o s i s) 或鸟疫(o r n i - t h o s i s) 。引入“ 鸟疫” 一词, 主要用来区别鹦鹉以外 的鸟类感染的禽衣原体病。实际上, 从鹦鹉及非鹦 鹉鸟类分离出的致病性衣原体株可以交叉感染
11、, 引 起同样的疾病 1。 鹦鹉热衣原体是一种细胞内寄生的微生物 2, 有8个血清型, 其中至少有6个血清型(A、B、C、D、 E和F) 可感染大多数宠物鸟、 家禽和野鸟 3,4。我 国家禽禽衣原体感染的发病率达1 0. 9 6%, 给养禽 业造成了严重的损失。 值得注意的是, 这些禽血清 收稿日期:2 0 0 5 - 0 9 - 2 1;修回日期:2 0 0 5 - 1 2 - 2 3 基金项目:国家高技术研究发展计划(8 6 3) 项目(2 0 0 3 AA 2 4 1 1 1 0) 作者简介:周继章(1 9 7 2) , 男, 青海乐都人, 助理研究员, 博士生。邱昌庆为通讯作者,E -
12、 m a i l: c i i i u 1 2 6. c o m 中国兽医科学 2 0 0 6, 3 6(0 1) :1 3 - 1 7 V e t e r i n a r yS c i e n c e i nC h i n a 流行株通过禽类感染人类, 可引起人的肺炎和脑炎 等重症, 严重危害或威胁人类健康。2 0世纪初, 流 行玩赏鹦鹉宠物, 鹦鹉感染鹦鹉热衣原体后传染给 玩赏者, 结果导致人的衣原体病( 鸟疫) 流行, 在美 洲、 欧洲和非洲有数百人死亡, 引起很大恐慌 57。 疫苗免疫是预防流行性疾病最有效的方法之 一。然而, 目前国内外还没有研制成功商品化禽衣 原体病疫苗。为满足市场
13、需求, 研制预防禽衣原体 病的高效疫苗势在必行。本研究旨在构建禽衣原体 主要外膜蛋白(MOMP) 基因组合的重组腺病毒质 粒, 为禽衣原体复制缺陷型腺病毒活载体疫苗的研 制奠定基础。 1 材料与方法 1. 1 载体、 工程菌和主要试剂 A d E a s y TMX L A d e n o v i r a lV e c t o r: 购自加拿大 S t r a t a g e n e公司;p MD1 8 - T载体、J M 1 0 9感受态细 胞、 P y r o b e s t TMD NAP o l y m e r a s e高保真酶、 限制性 内切酶S a l和B g l: 均购自大连宝
14、生物工程有 限公司; 限制性内切酶Pm e和P a c: 购自英国 B i o l a b s公司; 蛋白酶K: 购自上海生工生物工程技 术服务有限公司; 荧光素标记的兔抗羊二抗: 购自北 京中杉金桥生物技术有限公司。衣原体标准阴性、 阳性血清: 由笔者所在实验室提供。 1. 2 病原分离 采取疑似禽衣原体病鸡的病料, 经处理后接种 于7日龄鸡胚, 盲传3代, 收取接种后第7 2h规律 死亡的鸡胚卵黄囊, 进行如下鉴定: 涂片, 姬姆萨染 色, 镜检观察到大量原生小体(E B) 疑似颗粒而没有 见到其他任何细菌; 磺胺敏感试验、 碘染色试验均为 阴性, 接种人工培养基培养均不生长。因此, 确定
15、其 为鹦鹉热衣原体。 1. 3 引物设计 根据G e n B a n k中有关禽衣原体MOMP的基因 序列(L 2 5 4 3 6) , 利用D NA S t a r软件分析设计了1 对引物:CHL - M1: 5 - AT GAAAAAA C T CT T GA - AAT C G - 3 ;CHL - M 2:5 - T TAGAAT C T GAAT T - GAG C AT T C - 3 。该引物由大连宝生物工程有限公 司合成。 1. 4 基因组D N A的提取 按照参考文献 8 提取病料中的基因组D NA。 1. 5 SSP基因的扩增 在2 0 0LP C R反应管中加入1 0P
16、C R缓冲液 5L,d NT P4L, 上、 下游引物各1L, 模板6L, P y r o b e s t TMD NAP o l y m e r a s e高保真酶0. 2 5 L, 纯 净水3 2. 7 5L, 组成5 0L反应体系。反应条件如 下: 9 55m i n,9 41. 5m i n,4 91. 5m i n,7 2 2m i n, 共4 0个循环, 最后7 2延伸1 0m i n。 1. 6 SSP基因的克隆和测序 将P C R产物连接到p MD1 8 - T载体, 经转化、 涂板, 置3 7过夜培养, 挑取菌落进行鉴定, 送阳性 菌液测序。根据测序结果, 在原有引物上各设计
17、1 个酶切位点( 上游引物添加B g l酶切位点, 下游引 物添加S a l酶切位点) , 然后进行P C R扩增。将 扩增 产 物 连 接 到p MD 1 8 - T S i m p l e载 体, 转 入 J M 1 0 9感受态细菌中, 涂布于含5 0g/m L氨苄青 霉素的L B培养基平板, 置3 7培养箱培养1 21 6 h。挑取单个菌落进行酶切鉴定和P C R鉴定后选阳 性质粒进行测序。 1. 7 SSP基因与p s h u t t l e - CSW载体的连接 用B g l和S a l酶对阳性p MD1 8 - TS i m p l e 质粒进行双酶切, 回收目的片段。用T 4D
18、 NA连接 酶连接到已用B g l和S a l双酶切、 纯化、 回收的 p s h u t t l e - CMV载体中, 转入DH 5中, 涂布于含有 5 0g/m L卡那霉素的L B培养基平板, 置3 7培 养箱过夜培养, 挑取单个菌落, 进行酶切鉴定和 P C R鉴定。 1. 8 细菌内同源重组腺病毒质粒的构建 将经酶切鉴定和P C R鉴定的阳性p s h u t t l e - CMV质粒1 0L, 在25 0 0V、2 0 0、2 5F条件下, 电穿孔共转化8 0LB J 5 1 8 3感受态细胞, 用含有5 0 g /m L卡那霉素的L B培养基平板筛选, 3 7培养 箱培养1 6
19、2 0h后挑取8个克隆, 抽提质粒电泳鉴 定, 将重组子转化至DH 5 菌, 提取质粒, 进一步进 行酶切鉴定。 1. 9 重组腺病毒质粒在A D - 2 9 3细胞中的包装 提取重组腺病毒质粒大约3 0g, 加入到1. 5 m L无血清的DMEM培养基中, 轻轻混匀。取6 0 L的脂质体加入到1. 5m L无血清的DMEM 培养 基中, 混匀, 室温放置5m i n。将稀释好的重组腺病 毒加入到已稀释好的脂质体中, 室温放置2 0m i n。 取2m L脂质体- D NA混合物加入到2 4h内长满 9 5%的A D - 2 9 3细胞单层, 轻轻摇动细胞瓶。将细 胞瓶置3 7含有5 0m L
20、/LC O 2的培养箱中培养6 h, 然后加入6m L含有血清的DMEM培养基, 继续 培养37d。 1. 1 0 目的基因的P C R鉴定 取经过3次传代产生病变的A D - 2 9 3细胞, 反 复冻融3次, 取1m L冻融液, 加入1 0 0g/LS D S5 0 L和3L的蛋白酶K(0. 1m g /m L) ,6 0作用 41 中国兽医科学第3 6卷 3 0m i n, 然后置3 7作用2h, 用等体积的酚-氯仿- 异戊醇( 体积比为2 5:2 4:1) 混合液进行抽提, 提 取重组腺病毒D NA。用引物CHL - M 1和CHL - M 2 扩增衣原体MOMP基因。扩增条件: 9
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- 关 键 词:
- 鹦鹉 衣原体 MOMP 基因 重组 病毒 载体 构建 鉴定
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