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1、突变低氧诱导因子 1!基因真核表达载体的构建和表达 傅锐斌 1,吴平生2,宋云峰1,邱 建1,戴铁英2,李建华2,修建成2(1 广州军区广州总医院心内科,广东 广州 510010;2南方医科大学南方医院心内科,广东 广州510515) 摘要:目的 构建人低氧诱导因子-1!(HIF-1!)真核表达载体pcDNA3.13-HIF-1!的两种突变体pcDNA3.13-HIF-1!-545A67 和pcDNA3.13-HIF-1!-545A67-803A67,并检测它们在人肺微血管内皮细胞(H9:;?)密码子IBJ-=OFBJ2N PQNA RMB-SFBJ1N TIL UI7B1N DAI CIF-
2、VIBJ2N WI UI7B-OM72N XIL UI7B-cOFBJ2 1DFp7?GKFBG S ?545 (ccc) IB HIF-1! IBG Jcc (A67) IB pcDNA3.13-HIF-1! G HG7IB =IBJ6F-=IGF-KMG7GFY FcG? pcDNA3.13-HIF-1!-545A67N _OIcO _7= GOFB =MHFcGFY G 7 =FcBY =IGF-YI?FcGFY KMG7JFBF=I= G cBF?G GOF cYB= S? A=B803 IBG GO7G S A67 (JcG) G 7caMI?F YMH6F-=IGF-KMG7GFY
3、 pcDNA3.13-HIF-1!-545A67-803A67. ASGF? 6IpSFcGIB-KFYI7GFY G?7B=IFBG G?7B=S?K7GIB S H9:;?J?7K S AM7BJYBJ ?IBcF (?Ala DNA ABagCenD 4567c89:89; 8?7567/01573239A967A97,-.+1!3?67B9:6?2A96:C 图D7pcDNA3C1*+,-.+1!+/01A23+EF3A23测序结果图 FiE.F Gequen e analysis of p DHA3.1: +;?Ala+IJ3Ala DHA fBaECenD 4567c8:89;78
4、?7567EF3?:73239A967A97,-.+1!3?67B9:6?2A96:C 图377G4+H=G分析各组细胞,-.+1!和“+3cA97IGNA表达 FiE.3 KL+MNK analysis of ;8?I6: ST pcDNA3C1*+,-.+1!R pcDNA3C1*+,-.+1!+/01A23R 39: pcDNA3C 1*+,-.+1!+/01A23+EF3A23R ?6;p6cAU62T 算,-.+1!产物的相对量。 计算公式:,-.+1!相对光密 度值V,-.+1!产物电泳条带密度W“+3cA9条带密度。 1CDC1 免疫荧光分析将转化质粒细胞爬片固定后分 别结合一抗
5、 和二抗。 一抗为小鼠抗人,-.+1!单克隆 抗体,使用浓度为1:/FF;二抗为.-4=标记羊抗小鼠 二抗,使用浓度1:3D。 揩干封固后用倒置荧光显微镜 进行观察照片。 1CDC/ X6;6?9 S28分析依据蛋白提取试剂盒说明 提取各组转化细胞的总蛋白,然后存于-YF 冰箱中 备用。 电泳时每个上样孔上样量为1F #Z总蛋白样 本, 取各组样品蛋白分别与等体积 D 样品缓冲液混 匀,1FF / IA9变性,然后加到各加样孔。 蛋白电泳 凝胶积层胶浓度为/、分离胶为YC/。 电泳积层胶 电压为0F O、 分离胶电压为1DFO, 电泳时间约F IA9左右。 然后以01 O、11/ IA进行转膜
6、D1F分钟。 HOD.膜以含/脱脂奶粉的4L+4液1 封闭过 夜,分别结合一抗(1:/FF 小鼠抗人,-.+1!单克隆抗 体)1 3 5、二抗(1:D FFF 辣根过氧化物酶(,GH )标 记羊抗小鼠-Z)室温1C/ 5,在暗室中按进行化学发 光试剂增强反应,线片压片曝光约17IA9,经光密度 仪扫描分析, 以背景光密度进行标准校正, 计算 ,-.+1!蛋白的相对量_D!a值b。 1C377统计学处理 采用H1FCF统计软件,采用单因素方差分析, 两两比较采用JD方法。 数据以均数c标准误表示, Pd7FCF/为有统计学意义。 D77结果 DC177,-.+1!基因定点突变 DC1C177pc
7、DNA3C1*+,-.+1!第/01位脯氨酸(H?8)密码 子=突变为丙氨酸A23a密码子=7测序结果显 示已将,-.+1!编码序列上原第/01位脯氨酸密码 =突变成丙氨酸编码=,说明已构建成真核表 达载体pcDNA3C1*+,-.+1!+/01A23 (图 1)。 DC1CD77pcDNA3C1*+,-.+1!+/01A23第EF3位天冬酰胺 A;9a密码子AA4突变为丙氨酸A23a密码子=47测 序 结 果 显 示 已 将pcDNA3C1*+,-.+1!+/01A23上 ,-.+1!编码序列上原第EF3位天冬酰胺密码 AA4 突变成丙氨酸编码=4, 说明已构建成真核表达载 体pcDNA3C
8、1*+,-.+1!+/01A23+EF3A23 (图 D)。 DCD77pcDNA3C1*+,-.+1!、pcDNA3C1*+,-.+1!+/01A23和 pcDNA3C1*+,-.+1!+/01A23+EF3A23在,NOP=;中的 表达分析 DCDC177G4+H=G检测各组细胞,-.+1!IGNA表达 (图3) A、L、=和D组的相对D “a值分别为FCD0FCF/F、 FC1YFCF/1e、FC1EFCF1Ye和FC/1FCF0/e7ePdFCF17vs A 组a,L、=、D组显著高于A 组。 DCDCD7免疫荧光定性检测各组细胞,-.+1!蛋白表达 (图1) DCDC377X6;6?
9、97S28检测各组细胞,-.+1!蛋白表达 (图 /) 377讨论 P2;89等11发现:转化敲除fDD区的,-.+1!的 转基因动物的皮肤出现血管新生现象,这种新生血管 形态功能正常,明显优于OP.促生的腔大、扭曲和 通透性增加的新生血管, 说明,-.+1!可以作为促血 7777777777777777777777777777777777777777777777777777777777第一军医大学学报g7.A?;7NA27N6:7h9AUa777777777777777777777777777777777777777777777777777777777第D/卷13/F 图4 免疫荧光检测质粒
10、转染HMVECs HIF-1!蛋白表达效果 Fig.4 Immunofluores en e analysis of HIF-1! protein synthesis in HMVECs transformed by different plasmids A, B, C and D are the same as those in Fig.3. 图5 各种质粒转化后内皮细胞表达HIF-1!蛋白免 疫印迹结果 Fig.5 Western blotting of HIF-1! protein synthesis in HMVECs transformed by different plasmids
11、 A, B, C and D are the same as those in Fig.3. 管新生治疗剂。不过,通常情况下,大片段的基因缺失 可能引起蛋白某些可能还没被发现的功能的丧失。显 然发生点突变的HIF-1!基因所表达出的蛋白从结构 上和正常HIF-1!蛋白要接近得多,在改变蛋白的某些 特性、如易降解和易失活的同时,更有利于保留蛋白 的生理功能。 本研究通过定点突变HIF-1!基因564 脯氨酸和803天冬胺酰的密码构建了pcDNA3.1+- HIF-1!-564 Ala和pcDNA3.1+-HIF-1!-564Ala-803Ala 这两种点突变HIF-1!基因的真核表达载体, 定点
12、突 变结果得到测序的证实。 我们的研究证实,pcDNA3.1+-HIF-1!转染真核 细胞后细胞HIF-1!mRNA水平增高10。 本研究结果 表明,转染两种突变HIF-1!质粒后细胞HIF-1!mR- NA水平也显著增高;不过转染pcDNA3.1+-HIF-1!的 HMVECs的HIF-1!蛋白水平并未见明显增高,新构 建的两种质粒转染HMVECs后HIF-1!蛋白水平对 照组空白细胞组和转化pcDNA3.1+-HIF-1!细胞组显 著增高, 这说明HIF-1!遇氧降解主要发生于蛋白水 平,而不是发生于mRNA水平,而点突变质粒转染后 所表达的HIF-1!蛋白由于氧化降解的位点消失,因 而具
13、有抗氧化降解的特点。 既往的工作只是对HIF-1!基因的片段进行了突 变,构建成只含有突变HIF-1!功能区的表达载体,目 的是阐明HIF-1!蛋白的特性和其正常氧条件下细胞 内迅速降解以及失活的机制8, 9。 本研究利用已经阐 明的HIF-1!降解的机制,构建成突变HIF-1!的真核 表达载体, 目的是应用突变HIF-1!基因进行缺血性 心脏病的促心肌血管新生治疗。 新近研究还表明,纤 维蛋白酶能通过HIF-1进行降解。我们下一步的工作 需要对突变HIF-1!表达载体进行充分的功能鉴定, 以进行缺血性心脏病的治疗研究。 参考文献: 1Drake CJ, Little CD. Exogenou
14、s vascular endothelial growth factor induces malformed and hyperfused vessels during embryonic neo- vascularizationJ. Proc Natl Acad Sci, 1995, 92 (17): 7657-61. 2Epstein SE, Kornowski R, Fuchs S, et al. Angiogenesis therapy: amidst the hype, the neglected potential for serious side effectsJ. Circul
15、ation, 2001, 104(1): 115-9. 3Palmer LA, Semenza GL, Stoler MH, etal. Hypoxia induces type “NOS gene expression in pulmonary and systemic vascular cellsJ. Am J Physiol, 1998, 274(2 Pt 1): L212-9. 4Shweiki D, Itin A, Soffer D, et al. Vascular endothelial growth factor induced by hypoxia may mediate hy
16、poxia-initiated angiogenesisJ. Nature, 1992, 359(6398): 843-5. 5Firth JD, Ebert BL, Pugh CW, et al. Oxygen-regulated control ele- ments in the phosphoglycerate kinase 1 and lactate dehydrogenase A genes: similarities with the erythropoietin 3 enhancerJ. Proc Natl Acad Sci, 1994, 91(14): 6496-500. 6S
17、emenza GL, Roth PH, Fang HM, et al. Transcriptional regulation of genes encoding glycolytic enzymes by hypoxia-inducible factor 1 J. J Biol Chem, 1994, 269(38): 23757-63. 7Wang GL, Jiang BH, Rue EA, et al. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O
18、2 tensionJ. Proc Natl Acad Sci, 1995, 92(6): 5510-4. 8Bruick RK, McKnight SL. A conserved family of rolyl-4-hydroxy- lases that modify HIFJ. Science, 2001, 294(5545): 1337-40. 9Lando D, Peet DJ, Whelan DA, et al. Asparagine hydroxylation of the HIF transactivation domain a hypoxic switchJ. Science,
19、2002, 295(5556): 858-61. 10 傅锐斌, 吴平生, 戴铁英, 等. pcDNA3.1+-HIF-1!载体构建和初步 表达鉴定J. 第一军医大学学报, 2003, 23(11): 1134-36. Fu RB, Wu PS, Dai TY, et al. Construction and expression analysis of recombinant vector pcDNA3.1+-HIF-1!J. J First Mil Med U- niv/Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao, 2003, 23(11): 1134-36. 11Elson DA, Thurston G, Huang LE, et al. Induction of hypervascular- ity without leakage or inflammation in transgenic mice overexpress- ing hypoxia-inducible factor-1 alphaJ. Genes Dev, 2001, 5(19): 2520-32. 傅锐斌,等.突变低氧诱导因子 1! 基因真核表达载体的构建和表达第11期 1351
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