穿琥宁粉针剂体外抗HIV1作用.pdf
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1、研究原著文章编号: 1000-2790 (2006) 13-1163-03 穿琥宁粉针剂体外抗 HIV-1 作用 曾祥凤, 曾耀英,李海仙, 林长乐, 赵令斋, 李莉平, 肇静娴 (暨南大学组织移植与免疫教育部重点实验室, 广东 广州 510632 = ) 收稿日期: 2005-10-20; 接受日期: 2006-01-10 基金项目:“十五” 国家科技攻关计划中医药治疗艾滋病专项基金 (2004BA719A09-03) ; 国家自然科学基金面上项目 (30500466) ; 广东 省自然科学基金博士启动项目 (5300419) 通讯作者: 曾耀英. Tel:(020) 85226219 Em
2、ail: ozms jnu. edu. com 作者简介: 曾祥凤.硕士, 讲师.Tel: (020) 85220298 Fax: (020) 85221337 Email: zengxf868 sohu. com Anti-HIV-1 effect in vitro of Chuanhu- ning injection ZENG Xiang-Feng,ZENG Yao-Ying,LI Hai-Xian,LIN Chang- Le,ZHAO Lin-Zai,LI Li-Ping, ZHAO Jing-Xian Key Laboratory of Tissue Transplantation a
3、nd Immunology of Ministry of Education,Jinan University,Guangzhou 510632, China 【Abstract】AIM:To investigate the inhibitory effect of Chuan- huning(CHN)injection on human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)infection in vitro. METHODS:Calcein-AM stained H9/ HIV-1B cells were treated with serially d
4、iluted CHN injec- tion,then co-cultured with target cells MT-2,and HIV-1mediated cell fusion was observed under a fluorescent microscope. The pro- tective effect of CHN on HIV-1-infected cells was determined by MTT. Viral replication was evaluated by measuring the level of p24 antigen in culture sup
5、ernatants by ELISA. RESULTS:CHN injection could suppress the fusion of MT-2 and H9/ HIV-1B cells(EC50:5. 49 mg/ L, SI:327. 6) ,thus protecting HIV-1 infected cells from death(EC50:64. 57 mg/ L, SI:27. 85) ,and decreasing p24 antigen release(EC50: 194. 67 mg/ L, SI: 9. 23) . CONCLUSION:CHN injection
6、can inhibit HIV-1 infection in vitro. 【Keywords】Chuan-Hu-Ning;HIV-1;cell fusion;Calcien AM 【摘 要】目的:探讨穿琥宁粉针剂在体外是否具有抗 HIV 作用. 方法: 采用荧光染料 Calcien AM 标记 HIV 感染的慢性 H9 细胞 (H9/ HIV-1B) 与不同稀释浓度的穿琥宁药物作用 后, 与靶细胞 MT-2 细胞混合培养, 观察 MT-2 和 H9/ HIV-1 B 融合细胞的变化; MTT 法检测穿琥宁对 HIV 感染细胞的保 护作用; HIV-1P24 抗原试剂盒检测药物作用后的细胞培养
7、上 清 P24 抗原含量的变化. 结果: 穿琥宁粉针剂能够抑制 MT-2 和 H9/ HIV-1B 细胞融合 (其抑制融合的 EC50为5. 49 mg/ L, 选择指数 SI 为 327. 6) ; 能够保护 HIV 感染细胞的死亡 (EC50 为 64. 57 mg/ L, SI 为 27. 85) 和减少 HIV-1 P24 抗原的表达 (EC50为 194. 67 mg/ L, SI 为 9. 23) . 结论: 穿琥宁粉针剂在体 外具有抗 HIV-1 的作用. 【关键词】穿琥宁粉针剂; 艾滋病病毒; 细胞融合; 钙黄绿素 【中图号】R373. 2 【文献标识码】A 0 引言 随着我国
8、人类免疫缺陷病毒 (human immunodefi- ciency virus, HIV)感染流行形势的日益严重, 临床就 诊的 HIV 感染者/ AIDS ( acquired immunodeficiency syndrome) 患者在逐步增多, 临床治疗的压力越来越 大 1. 但由于我国治疗艾滋病的药物开发及研制工 作滞后, 故目前尚无疗效可靠, 经济实用的药物. 虽 然世界上有公认的治疗艾滋病有效的高效抗逆转录 酶病毒联合疗法 (highly active antiretroviral therapy, HAART) , 由于价格昂贵且副作用极大 2 -3, 难为我 国患者广泛接受并
9、长期应用. 因此, 研究和开发有效 的传统中药防治艾滋病非常重要. 穿琥宁是从穿心莲叶中提取的一种纯中药制剂, 属于一种低毒高效的抗病毒药. 具有抗炎、 抗病毒及 清热解毒的作用, 临床已广泛用于感染性疾病的治 疗, 尤其对病毒性疾病有较好的疗效 4 -5. 但穿琥宁 对 HIV/ AIDS 的作用报道很少,本研究用不同浓度 的穿琥宁和 H9/ HIV-1B 作用观察其是否具有抗 HIV-1 的作用. 1 材料和方法 1. 1 材料 中药穿琥宁粉针剂 (哈尔滨二联药业有 限公司) 用 PBS 配制为100 g/ L 存储液, 无菌分装, - 20贮存备用. AZT (叠氮胸苷)(3- Azid
10、o-3-deoxy- thymidine)(美国 Biochemika Fluka)100 mg, 用二甲 亚砜 (dimethyl sulfoxide,DMSO) 配成 100 g/ L , 分装 -20 贮存备用. 药物存储液于实验前用 RPMI- 1640 培养基按需要稀释至所需工作浓度. 钙黄绿素 (Calcein-AM, 美国 Molecular Probes) , 用 DMSO 溶解 配制成 1 mmol/ L, 分装,- 20 贮存备用. 噻唑蓝 (MTT,Sigma)PBS 配制 5 g/ L,- 20 贮存备用. P24 抗原检测试剂盒 (美国 ZeptoMetrix) .
11、RPMI-1640 3611 第四军医大学学报 (J Fourth Mil Med Univ) 2006; 27 (13) http: / / journal. fmmu. edu. cn 培养液 (美国 Gibco) ,配制时加入青霉素 1 105U/ L,链霉素 100 mg/ L,过滤除菌, 使用时加入 100 mL/ L(V/ V) 胎牛血清 (FBS) . HIV-1B 感染的慢 性 H9 细胞 (H9/ HIV-1B) 和 MT-2 细胞来自美国, 由南方医科大学免疫教研室惠赠. 1. 2 方法 1. 2. 1 细胞和病毒培养 H9/ HIV-1B 细胞和 MT- 2 细胞用含 1
12、00 mL/ L(V/ V) FBS 的 RPMI-1640 培养 基在 37, 50 mL/ L CO2培养箱培养, 2 3 d 传代 1 次. 进行药物实验前1 d 再传代换液1 次使细胞处于 对数生长期. 1. 2. 2 穿琥宁对细胞的毒性测定 采用 MTT 法 6 分别测定穿琥宁对 MT-2 细胞和 H9/ HIV-1B 细胞 毒性. 观察细胞存活率和求出 CC50浓度 (50% cyto- toxic concentration, 即对 50%宿主细胞产生细胞毒作 用时的药物浓度) . 细胞存活率 = (实验组 A 均值/ 对 照组 A 均值)100%) . 根据细胞存活率按照 Re
13、ed- Muench 法求出 CC50浓度. 1. 2. 3 药物对 H9/ HIV-1B 细胞与 MT-2 细胞早期 融合的影响 H9/ HIV-1B 细胞用分子荧光探针 Calcein-AM 荧光染色: 收集对数生长期的 H9/ HIV-1 B 细胞, 计数并配制 4 108/ L 细胞悬液. 按 1 mL H9/ HIV-1B 细胞加入 2. 5 L 1 mmol/ L Calcein- AM. 37 孵育 30 min. PBS 洗涤 2 次, 再用含 100 mL/ L FBS 的 RPMI-1640 培养液重悬细胞, 再计数并 调整细胞浓度为 4 108/ L. H9/ HIV-1
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