筛选适用于小型猪遗传检测的微卫星位点.pdf
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1、2 0 0 9 年2 月 第1 9 卷第2 期 中国比较医学杂志 C H I N E S EJ O U R N A LO FC O M P A R A T I V EM E D I C I N E F e b r u a r y ,2 0 0 9 V 0 1 1 9N o 2 庐口 “匐 g 研究报告$ 延 、e A 、:目、;e ;、妙 筛选适用于小型猪遗传检测的微卫星位点 徐玲玲,吴艳花,路静,陈振文 ( 首都医科大学实验动物学系,北京1 0 0 0 6 9 ) 【摘要】目的筛选用于封闭群小型猪遗传检测的微卫星位点。方法 从资料和G e n B a n k 中选取扩增效果 好、等位基因多、
2、均匀分布于小型猪1 8 条常染色体和x 染色体上的1 0 0 个微卫星位点,合成引物,对封闭群小型猪 基因组进行P C R 扩增及条件优化。P C R 产物采用琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳和S T R 扫描技术进行分析 和比较,选择多态性好的位点。结果筛选出3 2 个分布于不同染色体且等位基因多的微卫星位点。结论 筛选 出了应用于封闭群小型猪遗传检测的微卫星位点。 【关键词】小型猪;微卫星D N A ;遗传检测 【中图分类号】R 3 3【文献标识码】A【文章编号】1 6 7 1 7 8 5 6 ( 2 0 0 9 ) 0 2 - 0 0 1 1 - 0 6 I s o l a t i o
3、 no fM i c r o s a t e l l i t eL o c if o r M i n i a t u r eP i gG e n e t i cM o n i t o r i n g X UL i n g l i n g ,W UY a n f u a ,L UJ i n ,C H E NZ h e n - w e n ( D e p a r t m e n to fL a b o r a t o r yA n i m a lS c i e n c e ,C a p i t a lU n i v e r s i t yo fM e d i c a lS c i e n c e
4、s ,B e i j i n g1 0 0 0 6 9 ,C h i n a ) 【A b s t r a c t 】O b j e c t i v e T oi s o l a t em i c m s a t e l l i t el o c i f o r3c l o s e ds t r a i n so fm i n i a t u r ep i gg e n e t i cm o n i t o r i n g M e t h e d s At o t a lo f1 0 0m i c m s a t e l l i t el o c io n18e u c h r o m o s
5、 o m e sa n dXf l e xc h r o m o s o m eo ft h em i n i a t u r ep i gw e r ec h o s e nf r o mG e n B a n ka n d t h el i t e r a t u r e G e n o m eD N Ao ft h e3c l o s e ds t r a i n so fm i n i a t u r ep i gw a sa m p l i f i e da n dt h eb e s tc o n d i t i o n sf o rP C Ra m p l i f i c a t
6、 i o n w e r ec h o s e n P C Rp r o d u c t sw e r ee v a l u a t e db yg e le l e c t r o p h o r e s i s ,P A G Ea n dG e n e s c a n L o c iw i t hh i s hp o l y m o r p h i s mw e r e c h o s e n R e s u l t s T h i r t yt w om i c r o s a t e l l i t el o c io nd i f f e r e n tc h r o m o s o
7、 m e sw i t hh i s hp o l y m o r p h i s mw e r s e l e c t e d C o n c l u t s i o n M i c r o s a t e l l i t el o c is u i t a b l ef o rt h e3c l o s e ds t r a i n so fm i n i a t u r ep i gg e n e t i cm o n i t o r i n gh a v eb e e ni s o l a t e d 【K e yw o r d s 】 M i n i a t u r eP i g ;
8、M i c r o s a t e l l i t eD N A ;P o l y m o r p h i s m ;G e n e t i cm o n i t o r i n g 实验动物遗传监测是评定和保证实验动物质量 的一项常规工作。现代分子生物学技术的发展,使 得直接利用D N A 分子中的核苷酸序列的变异进行 遗传检测成为可能,其中微卫星D N A ( m i c r o s a t e l l i t e D N A ) ,以其信息含量高,分布广泛,高度多态性,测 定快捷等特点2 】,有着广泛的应用前景。但是从目 前国内的小型猪微卫星的研究状况看,进行群体遗 传分析所应用的微卫星
9、位点极不统一,微卫星多态 性较差,微卫星D N A 遗传检测方法和标准尚未建 立b 4 。本研究汇集文献报道和从G e n B a n k 中查找 的1 0 0 个小型猪微卫星位点,对三个小型猪封闭群 进行P C R 扩增,筛选扩增效率高,多态性良好的适 用于封闭群小型猪遗传检测的微卫星位点,为小型 猪遗传检测方法和标准的建立奠定基础。 1 材料 1 1 小型猪基因组D N A 样本来源 实验采用3 个小型猪封闭群的基因组D N A ,每 基金项目】北京市科技计划重大专项项目:实验用小型猪与实验鱼类地方标准研究,N o :D 0 7 0 8 0 2 0 0 7 2 0 7 0 1 。 作者简介
10、】徐玲玲( 1 9 8 3 ) ,女,硕士研究生,专业方向:分子遗传学。 通讯作者】陈振文( 1 9 5 9 ) ,男,教授,博士,E m a i l :c z w e n s o h u c o m 。 万方数据 1 2 中国比较医学杂志2 0 0 9 年2 月第1 9 卷第2 期C h i nJC o m p M e d ,F e b r u a r y2 0 0 9 ,V 0 1 1 9 N o 2 个群体3 5 个样本,总计1 0 5 个样本。样本避开同窝 个体,由农科院北京畜牧兽医研究所遗传室馈赠。 1 2 仪器设备与试剂 P C R 扩增仪:B I O R A D 公司A L S
11、l 2 9 6 型。电泳 仪:B I O R A D 公司P O W E RP A C 3 0 0 型。S T R 扫描仪: A B I P r i s m T M 3 7 7D N As e q u e n c e 。蛋白酶K 、T a qD N A 聚合酶、d N T P 和M g c l 2 购于大连宝生物工程有限公 司,微卫星引物由上海生物工程公司合成,荧光标记 微卫星引物由北京基诺博实生物技术有限公司合 成。 2 方法 2 1 微卫星位点的选择 本实验根据世界粮农组织( F A O ) 和国际动物遗 传协会( I S A G ) 联合推荐的2 7 个位点,李奎等人选出 的用于中国实验
12、用小型猪近交系遗传监测的微卫星 位点2 1 个,R o h r e rGA 等b 1 所做的10 0 0 多个小型 猪微卫星位点,以及从G e n e B a n k 中筛选出的一些位 点作为备选。依据位点均匀分布于小型猪的l 。1 8 号染色体和x 染色体上、扩增效果好、等位基因多、 多态性好等为原则,筛选出1 0 0 个微卫星位点作为 用于小型猪遗传检测的备选微卫星位点。 2 2P C R 反应条件优化和琼脂糖凝胶电泳初选微 卫星位点 每次从3 个群体样本中分别抽取3 个样本( 共9 个样本) D N A 作为微卫星位点筛选的P C R 扩增模 版。P C R 反应体系为1 5 止,其中:
13、1 0 b u f f e r :1 5 弘L ,上下游引物( 1 0 0p m o l b t L ) 各1t z L ,4 d N T P1 0 0 t t m o l L :1t t L ,T a q 酶1 U :1t t L ,5 0n g 一1 0 0n g 基因组 D N A :1t t L ,纯水( d d H :O ) :8 5t t L ,扩增条件:9 4 。C 预 变性5m i n ,9 4 c c 变性3 0s ,退火温度3 0s ,7 2 延伸 3 0s ,3 5 个循环,接7 2 继续延伸7m i n 。取扩增产 物8 皿经1 5 的琼脂糖凝胶电泳1 4 0V ,3
14、0m i n ,成 相拍照。第一步,根据报道的反应条件进行P C R 扩 增,挑选出扩增效果好的位点保留。第二步,扩增不 理想的位点进一步变换条件再次进行P C R 扩增。 影响P C R 扩增结果的主要因素是M 9 2 + 浓度和退火 温度,固定其它因素,M 9 2 + 浓度设为1 5m m o l L 、2 0 m m o l L 、2 5m m o l L 与3 0m m o l L4 个梯度,退火温 度以1 为温度梯度,以报道温度为标准上下各设 立3 个温度,即共设立6 个温度值。经琼脂糖凝胶 电泳后,条带清晰,只有一条或两条,且条带大小位 于( 5 0 3 5 0 ) b p 范围内
15、,记录优化的M g + 浓度和退 火温度,并把该位点作为被选位点,淘汰扩增效果差 的位点。第三步,经上面两个步骤筛选出的位点中, 再次根据琼脂糖凝胶电泳结果初步判断该位点的多 态性,将等位基因数大于3 个的位点保留,淘汰其它 位点。 2 3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 经琼脂糖凝胶电泳检测筛选出的位点的P C R 扩增产物,取6t t L 经8 的聚丙烯酰胺凝胶电泳1 0 0 V ,1 5h ,银染哺 ,拍照。根据聚丙烯酰胺凝胶电泳 图象结果,运用B I O P r o f i l eP m g r a m e 初步统计分析, 得到各个位点的等位基因数目。 2 4S T R 扫描 经过聚丙烯酰胺凝胶电
16、泳法,筛选出等位基因 大于等于5 的位点,对这些位点的引物进行5 荧光 标记,荧光标记分为3 种F A M 、H E X 、T A M R A 。以3 个封闭群小型猪1 0 5 个基因组D N A 为模版,运用合 成的荧光引物进行扩增,P C R 反应条件以上述实验 确定的优化条件为准,反应体系1 5 止。将3 种荧光 标记的扩增产物体积比以1 :3 :5 的比例混合,共得 到1 0 5 个混合样品,每个样品取1t t L 进行S T R 扫 描。 2 5S T R 扫描结果的判读与统计分析 扫描结果出现两种波形:一种为纯合基因型,只 有一个主波;另一种为杂和基因型,有两个主波。波 形见图1
17、、2 。同时,根据软件读出波峰处的扩增产 物的大小。 图1 纯合子波形主波波峰高1 5 5 7 波峰大小1 7 2b p F i g 1 T h ew a v e f o r mo fh e t e r o z y g o s i t y T h ep e a kh e i g h t w 船1 5 5 7a n dt h ep e a ks i z eW a S1 7 2b p 由G e n e S e a n3 7 软件读出3 个群体1 0 5 个样本 在每个微卫星位点的扩增片断大小。每个位点的等 位基因根据扩增片断大小从小到大顺序排列纪录为 a 、b 、c 、d 等。将所有样本的每个微卫
18、星位点的基因 型以a b 、b b ,等形式输入P o p g e n e 3 2 软件的数据文件 万方数据 中国比较医学杂志2 0 0 9 年2 月第1 9 卷第2 期C h i nIC o m pM e d ,F e b r u a r y2 0 0 9 ,V 0 1 1 9 N o 2 1 3 第一个主波波峰高1 2 5 9 波峰大小1 7 1b p ;第二个主波波峰高 1 7 8 9 波峰大小1 8 3b p 两个主波相差1 2b p 图2 杂合子波形 T h ef i r s td o m i n a n tw a v ep e a kh e i s a tW f l S1 2 5
19、9a n dt h ep e a ks i z eW M 1 7 lb p T h es e c o n dd o m i n a n tW a V e p e a kh e i g h t 1 7 8 9a n dp e a k s i z eW a g1 8 3b p T h ed i f f e r e n c ew a s1 2b p F i g 2 T h ew a v e f o r mo fh e t e m z y g o s i t y 以供统计分析。 运用P o p g e n e 3 2 软件,分析得到在每个微卫星位 点上1 0 5 个样本的平均观察等位基因数、有效等位
20、基因数。观察等位基因数和有效等位基因数都较高 的位点作为最后确定的被选位点。 3 结果 3 1 P C R 反应条件的优化和微卫星位点初步筛选 1 0 0 个微卫星位点中扩增产物经琼脂糖凝胶电 泳出现1 2 条清晰图带,且扩增结果重复性好,扩 增条带位于5 0b p 3 5 0b p 范围内的位点有8 5 个。 在这8 5 个位点中,有4 8 个位点的扩增条件与报道 的一致,另有3 7 个位点经过对退火温度和M 9 2 + 浓 度两个条件的优化后,扩增出了理想的条带。这些 位点的P C R 优化反应条件见表1 。 3 2 微卫星位点的优化 8 5 个位点的P C R 扩增产物经运用琼脂糖凝胶
21、电泳分析,电泳图带显示等位基因数大于等于3 的 位点有6 7 个。将这6 7 个位点的P C R 扩增产物经 8 的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,等位基因数目大于 等于5 的位点保留。这样得到4 8 个位点。将这4 8 个位点的引物进行荧光标记,P C R 扩增来自3 个群 体的1 0 5 个样本,产物进行S T R 扫描,扫描出现纯合 ( 图1 ) 与杂合( 图2 ) 位点的2 种基本波形。每个波 群包括一个主波,即波峰最高的波,主波前面由低到 高排列的波都是主波影子带【7 】。运用P o p g e n e 3 2 软 件分析后,最后确立3 2 个微卫星位点,各位点的 P C R 扩增条件、扩增
22、片段长度范围及等位基因数见 表1 。 3 3 琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、S T R 扫描三种方法检测等位基因数的比较 用S W r l 5 8 位点对1 0 5 个小型猪样本进行扩增, 扩增产物经1 5 的琼脂糖凝胶电泳,显示该位点 有4 个等位基因,等位基因大小范围在1 5 0b p 一2 5 0 b p ,4 个等位基因大小约1 6 0b p 、1 8 0b p 、2 0 0b p 、2 2 0 b p 如图3 。 M 为m a r k e r ;1 9 为动物编号 图3 三种小型猪在S w r l 5 8 座位琼脂糖凝胶电泳图 M :m a r k e r ;1 9 :s e
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