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1、 5 中国 实用神经疾病杂志2 0 0 5 年3 月第1 1 卷第5 期 C h i n 俘 e J o u r n a l o f p r a c t ic alN e rv o u s D is e a s e s M a r 2 0 0 8 , v o l l l N o 3 米诺环素对大鼠局灶性脑缺血再灌注后I C A M一 1 表达的影响 徐辉白宏英 郑州大学第二附属医院神经内 科郑州 4 5 0 O 1 4 【 摘要】 目的观察米诺环素对大鼠 短暂性脑缺血再灌注后细胞间钻附分子 1 表达的影响.方法采用改良线栓法制备大 鼠 大脑中动脉缺血Z h 再灌注24h 模型, 随机分为假手术
2、组、 缺血再灌注模型组、 米诺环素处理组和米诺环素预处理组, 每组16 只。 模型成功后观测各组大鼠的神经行为变化、 脑梗死体积以及H E 染色计数缺血区中性粒细胞的浸润数目, 应用免疫组化方法 检测细胞间钻附分子一 1 的 表达情况。 结果 米诺环素能明显改善大鼠局灶性脑缺血再灌注引起的神经行为障碍, 减少脑梗死体 积, 减少脑缺血引起细胞间 毅附分子1 的 表达, 抑制中性粒细胞的浸润. 结论米诺环素对大鼠局灶脑缺血再灌足损伤有保护作 用, 抑制猫附分子可能是一种机制。 【 关键词】 米诺环素; 脑缺血再灌注; 细胞间猫附分子 1 【 中图分类号I R 一3 3 2E 文献标识码 A【 文
3、章编号1 1 6 7 3 一 5 1 1 0 ( 2 0 0 8 ) 0 3 一 0 0 0 5 一 0 3 I n fl u e n c e o f Mi n ocy c l i n eon exp r es s i o no f i n t e rce l l u l a ra d h e s i o nm o l e c u I e-li nr a tsa fterf oca l cereb r a l i s c h emi a reP e r f usi o n X u H u i , Bai H o n g , i n g , DeP a rt m e n t o fNeo ro
4、l o g 夕 , t h e s e C o n d A f f i l i a t e dH o s 户 i t a l o fZhe n g zho “饰1 * rs t 少 , 2 入 e n g z h o u4 5 0 0 1 4 , 0滋 i na 【 A 加 t ract3 0 bJ ect i ve To o b s e r v e t h e i n f l u e nce o f Mi noc y c l i n e o n t h e e x p r e s s i o n o f i n t e r c e l l u l a r a d h e s i o nm o
5、 l e c u l e-1 ( I C A M一 1 ) p r o t e i n a f t e r fo c a l c e r e b r a l i s c h e 而a r e p e r f u s i o ni nr a t s .M e t h ods R a t m o d e l s w e r e e s t a b l i s h e dw i t hf i l a m e n t m e t h o da f t e r 2 一 hou r m i d d l e c e r e b r a l a r t e r y i s c h e m i a a n d2
6、 4 一 hou r r e p e r f u s i o n , a nd w e r e d i v i d e di n t o f o u r g r o u p s ran d o m l y : s h a 价o p e r a t e dg r o u p , m ode l g r o u p , t r eat m e n t g r o u p a nd p re t rea 恤e n t g r o u p w i t h1 6 r a t s i n e a c h g rou p . A f t e r t h e mo d e l e s t a b l i s
7、h m e n t s , t h e c h a n g e o f n e u r o l o g i - c a l i m p a i r m e n t a nd t h e v o l u m e o f c e r e b r a l i 可 a r c t io n w e r e e v a l u a t ed. T h e i n f i l t r a t i o n o f n e u t rop h i l i ni s c h e m i a a r e a s w a s c o u n t e db y h e mat o x y l in- eo s i n
8、 s t a i n i n g , 云 n d t h e e 却r e s s io n o f I C A M 一 l p ro t e i n w a s t e s t e d b y i m m u noh is t o c h e m i c a l m e t h od. R es u l ts M inoc y c l in e c o u l di m P rov e t h e n e u r o l o g i c a l i m p a i r m e n t , d e c r e a s e dt h ei 时a r c t e dv o l u m ea n d
9、r 曰u c e dt h ee x p r e s s i o ns o f ICA M, 1 , r e s t r a i n ed t he i n f i l t r a t i o no f n e u t r o p h i l s oa s torel i e v e t h e i n f l a m m a t o r yr e a c t iO na nd h a dneu rop rot e c t i v e e f f e c t a f t e r foc a l c e r e b r a 1 i s c h e m i a .C on- d usi onMi
10、noc y c l i n e p l a y s a nn e u r o p rot ect i v e e f f e c t a f t e r foc a l c e r e b r a l i s c h e m i a r e p e r f u s i o n b yr edu c i n gt h e e x P r e s s i o n s o f I C A M一 1 . t K eyw o r dsMi noc y c l i ne; Cer e b r a l i s c h e mi ar e p e r f u s i o n ; I C A M- 1 缺血性脑
11、卒中是临床最常见的致命性神经疾病。 在发达国家, 它已经是首要的致残原因 1 , 是仅次于心 脏病和癌症之后的第三位的致死原因。动物实验发 现, 抑制白细胞的豁附能减轻神经元的损伤。米诺环 素作为一种半合成的四环素类抗生素, 具有很宽的抗 菌谱、 很强的抗菌活性和很好的耐受性, 在临床上应用 很广, 很多研究发现它除了抗菌外还具有脑保护作用: 抑制基质金属蛋白酶家族图和i N O S 3 的活性, 抑制线 粒体细胞色素酶C的释放4j, 抑制ca sPas e 依赖和非 依赖的细胞死亡途径等。但在大鼠脑缺血再灌注模型 中抑制赫附分子是否为米诺环素的脑保护作用机制之 一, 至今鲜有文献报道。 1
12、材料与方法 1 . 1 材料 1 . 1 . 1 实验动物: 健康雄性成年清洁级 S D大鼠 64 只, 体质量2 50一3 20 9 , 由河南省实验动物中心提供。 大鼠随机分为假手术组、 脑缺血再灌注组、 米诺环素处 理组和米诺环素预处理组, 每组 16只, 8只用于免疫 组化和 HE染色, 8只用于测量脑梗死体积。 1 . 1 . 2 主要试剂: 米诺环素为美国S i g m a 公司产品, 鼠抗大鼠I C A M一 1 单抗为 SantaC ru: 公司产品; 过氧 化物酶标记的链霉卵白素试剂盒( S Pki t ) 、 D A B显色 试剂盒为北京中杉生物制品有限公司产品。 1 .
13、1 . 3 主要实验器材: H S SI 数字式超级恒温浴槽 ( 成都仪器厂) , B S 2 0 0 S型电子天平( 北京赛多利公 司) , 医用低温电冰箱( 日本日 立公司) , 光学显微镜( 日 本O L MP U S), 无创动脉夹( 苏州医疗仪器厂) , 单股尼 龙栓线( 日本) , 电凝器( 自制) 。 1 . 2 方法 1 . 2 . 1 动物模型制作: 根据改良的L o n g a 法固制成 大脑中动脉闭塞模型。假手术组除栓线插人深度不 同, 其余步骤同模型组。米诺环素处理组步骤同模型 组, 但在插线成功Z h 后给予米诺环素90m g / k g 腹腔 注射, 假手术组与模型
14、组均给予等量生理盐水腹腔注 射。米诺环素预处理组在缺血再灌注前 12 h给予米 诺环素90 m g / k g 腹腔注射, 以后 1 次/d, 直到大鼠处 死。大鼠在手术中均用白炽灯加热, 以保持体温恒定 ( 肛温37左右) , 苏醒后出现血管栓塞的同侧 Hor- 万方数据 6中国实用神经疾病杂志 2 0 0 8 年 3 月第 1 1 卷第 3 期C h i n e s e j o u r n a l o f P ra c t ic a l N e r v o u , D i s eas e s Ma r . 2 0 0 8 , V o l. l l N o . 3 n o r 征和对侧肢体运
15、动障碍即为模型成功。 1 . 2 . 2 评估标准: 神经行为学评分参考 Zea 一 L onga 等困的6 级评分法开始于缺血Z h 再灌注24h 。 。 分: 无神经损伤症状; 1 分: 不能完全伸展对侧前爪; 2 分: 向外侧转圈; 3 分: 向对侧倾倒; 4 分: 不能自 发行走, 意 识丧失; 5 分: 死亡。 1 . 2 . 3 脑梗死灶测量: 大鼠在缺血 Zh再灌注 24 h 后100 9 / L 水合氯醛深麻醉后处死, 迅速断头取脑, 放 人冰箱冻至适当硬度, 取其前脑从视交叉处由额极到 枕极切成Z m m厚的冠状面脑片, 置人20 9 / L红四氮 哩溶液中37孵育30 m
16、in。然后用40 9 / L甲醛缓冲 液固定。24 h 后拍照并输人计算机, 用 A U T 仔C A D 图像处理软件计算梗死面积( 粉红色区为正常脑组织, 白色区为梗死区) , 各脑片梗死面积之和乘以厚度 (2m m ) 为总的梗死体积, 以梗死体积与全脑体积之比 作为统计参数。 1 . 2 , 4 标本的制备: 各组大鼠达到缺血再灌注时限 后, 1 0 0 9 / L水合氯醛麻醉后迅速开胸暴露心脏, 经升 主动脉插管, 先用生理盐水 2 00 m l 快速冲洗, 然后以 40 9 / L多聚甲醛磷酸缓冲液(4, p H7 . 4)灌注后迅 速取脑, 以体积分数。 . 1 的中性甲醛后固定
17、, 常规石蜡 包埋, 自视交叉处连续作 4 个冠状切片, 取3 片做免疫 组化染色, 片 厚6 拌 m , 另一张切片 作苏木 精 一 伊红染色。 1 . 2 . 5 免疫组化结果判定: 细胞间乳附分子 1 结果用 半定量分析, 每张切片在缺血侧随机取 8 个高倍镜视 野, 计数染成深棕色的阳性血管数目, 计算平均值。 1 . 2 . 6 病理学观察: 经苏木精一 伊红染色的脑片置于 光镜下观察具体的病理变化, 在梗死区以1 个高倍视 野为 1 个单位面积, 连续计数 8 个视野内中性粒细胞 浸润的数目, 重复 3 次, 取其平均值。 1 . 2 . 7 主要观察指标: 各组动物神经行为学及脑
18、梗死 体积的变化、 脑组织形态结构的变化和细胞间薪附分 子 1 的表达。 1 。 2 。 8 统计学分析: 采用 S P S Sn . 。统计软件进行 素方差分析。P 0 . 05 为差异有统计学意义。 2 结果 2 . 1 描述性统计实验中假手术组未见有动物死亡, 缺血再灌注模型组 7 只动物死亡, 米诺环素处理组 5 只动物死亡, 米诺环素预处理组 6只死亡。术后解剖 动物发现均为蛛网膜下腔出血所致, 可能为操作过程 中线栓戳破血管所致, 补齐每组动物的数量。 2 . 2 统计推断 2 。 2 . 1 神经行为学及脑梗死体积的变化: 米诺环素 处理组和预处理组及缺血再灌注模型组动物均有不同
19、 程度的神经功能缺损, 且米诺环素处理组和预处理组 动物神经功能有改善( 尸 0 . 0 5 ) ; 米诺环素处理组和预 处理组梗死体积小于缺血再灌注模型组, 差异有统计学 意义( 尸 0 . 0 5), 米诺环素预处理组的梗死体积小于米 诺环素处理组伊0 . o 5 ) , 假手术组未见梗死灶。 2 . 2 . 2 脑组织形态结构的变化: 光镜检查见假手术 组细胞形态正常, 核仁清楚, 神经细胞及毛细血管周围 间隙正常, 间质内未见出血、 坏死及水肿, 未见中性粒 细胞浸润; 缺血再灌注模型组左侧大脑缺血范围内皮 质水肿明显, 神经细胞外周隙扩大, 毛细血管周隙增 宽, 血管内血栓形成, 皮
20、质和纹状体可见大量死亡神经 元, 可见筛状坏死灶, 间质水肿呈松网状, 有大量中性 粒细胞浸润; 米诺环素处理组和预处理组大脑皮质神 经细胞层次尚清晰, 未见明显坏死灶, 神经细胞及毛细 血管周围间隙稍大, 但明显小于缺血再灌注模型组。 间质水肿、 中性粒细胞的浸润也轻于缺血再灌注模型 组, 中性粒细胞的浸润数见表1 。 2 . 2 . 3 细胞间乳附分子 1 的表达: 阳性反应的细胞 间钻附分子1 主要见于脑缺血侧梗死区及其周围的毛 细血管壁, 呈深棕色, 于神经元和胶质细胞也可见。米 诺环素处理组阳性反应血管的表达较缺血再灌注模型 组减少( 尸 0 . 05) , 然而, 米诺环素预处理组
21、表达的阳 性反应血管表达比米诺环素处理组减少( 尸 0 . 0 5 ) 。 统计学处理, 结果用( 了 士: ) 表示。组间比较采用单因 表 1 各组大鼠局灶性脑缺血 Zh再灌注24h 后神经行为学、 脑梗死体积、 ICA M 一 1 的表达和中性粒细胞浸润数的变化( 了 士, ) 组别 假手术组 缺血再灌注组 米诺环素处理组 米诺环素预处理组 刀 1 6 1 6 1 6 1 6 神经行为学评分 0 1 , 8 士 0 . 1 4 1 . 4 士 0 . 3 0 . 1 , 2 士 0 . 1 5 . I CAM一 1、 脑梗死体积 3 . 6 8 5 士3 . 1 7 5 4 , 7 7 士
22、7 . 9 1 2 9 . 7 1 士8 . 3 8 . 2 2 . 2 8 士4 . 5 0 . 中性粒细胞浸润数 0 . 3 4士 0 . 3 2 3 1 , 2 1 士 2 。 3 5 2 0 . 3 5 士 1 . 4 9 . 1 8 . 9 3 士 1 . 7 1 . 0 3 1 , 5 7 土3 . 4 5 2 1 . 2 1 士2 . 1 4 A . 1 9 . 2 9 士1 . 5 5 , 与缺血再灌注组比, . 尸 0 , 05; 与假手术组比, 盛 尸 0 . 05; 与米诺环素处理组比, . 尸 。 . 05 3 讨论 脑缺血再灌注损伤的研究显示, 缺血过程中白细 胞乳附
23、于微血管内皮细胞表面, 一方面可机械性堵塞 微循环通道, 影响组织的血液供应, 另一方面活化由 万方数据 中国实用神经疾病杂志2 0 0 8 年3 月第1 1 卷第3 期C h i n e s e j o u r n a l o f P ra c t i c a l N e rvo u s 场s eas e s Ma r 2 o o 8 , V ul . l l N o , 3 7 基、 蛋白水解酶、 炎症介质和细胞因子等, 损害局部血 管, 导致血管通透性增加, 造成组织水肿, 破坏幸存的 神经元和胶质细胞, 从而加重神经组织的损伤, 并吸引 更多的白细胞进人组织, 形成恶性循环, 直到组织
24、完全 破坏。而周围血中白细胞向缺血区迁移的主要原因在 于血管内皮细胞及白细胞表面乳附分子的表达。猫附 分子以配体一 受体相对应的形式发挥作用, 介导细胞与 细胞间、 细胞与细胞外基质月或细胞一 基质一 细胞之间 的勃附。细胞间豁附分子 1 是最重要的白细胞一 内皮 细胞间猫附分子, 在体内分布较广, 但在血管内皮细胞 表达最强。正常情况下不表达或仅低水平表达, 在缺 血再灌注损伤等 情况下受白 细胞介素1 日 、 肿瘤坏死因 子及干扰素y 等细胞因子诱导, 微血管内皮细胞间薪 附分子表达增强。Wang 等阁发现大鼠缺血侧脑组织 内I C A M-l mR N A于缺血后 3 h开始升高, 6
25、12 h 达 高峰, 此后逐渐降低, 缺血后第 sd 仍高于正常水平。 St animirovi c 等 团发现培养的 人脑血管内皮细胞在体 外经历缺血样损害后能迅速分泌 ICA M-1 。抑制 ICA M 一 1 能够减轻脑缺血再灌注损伤。B row s e 等圈 在兔脑梗死模型中使用抗I C A M 1 抗体能明显降低脑 缺血损伤的程度, Z han g 等图报道在大鼠脑缺血再灌 注模型中使用抗 I C A M一 1 单克隆抗体, 可以缩小梗死 范围, 减轻白细胞浸润, 持续3 一s d 。 本实验结果提示缺血再灌注模型组大鼠脑组织 I C A M一 1 表达较假手术组增加, 差异有统计学
26、意义, 并 且大鼠脑组织白细胞的浸润、 神经学评分和脑梗死体 积都有显著的增加, 提示并验证 IcA M 一 1 参与了缺血 损伤。机制可能是 ICA Mee l 在缺血和非缺血区域内微 血管内皮细胞的表达促进白细胞砧附, 进而加重组织 炎症浸润和微循环障碍, 最后导致不可逆的损害。然 而, 米诺环素处理组大鼠缺血再灌注区ICA M 一 1 免疫 阳性微血管数明显低于模型组, 并且其相应区域的中 性粒细胞浸润及神经细胞损伤也轻于模型组, 表明米 诺环素对脑缺血再灌注后 ICAM一 1 的上调有一定的抑 制作用, 从而对抗血管内皮细胞与白细胞的赫附, 抑制 炎症反应。推测可能与其抗炎作用有关,
27、核转录因子 ( N F B)可能起重要的作用10 , 其作用机制尚待进一 步探讨。 此外还发现, 虽然细胞间豁附分子 1 主要表 达于微血管内皮, 但坏死周边区的神经元也存在, 而在 其他区域神经元极少表达, 与以往实验报道一致l1 。 本人认为, 脑缺血再灌流后, 缺血区域组织及浸润粒细 胞均可能大量生成炎性细胞因子, 刺激半暗带神经元 表达细胞间勃附分子 1 , 促进白细胞勃附, 进而加强白 细胞的破坏作用, 使梗死扩大。最后, 实验还发现米诺 环素在大鼠脑缺血前给药, 能更好减轻大鼠缺血再灌 注区ICA M一 1 免疫阳性微血管数、 相应区域的中性粒 细胞浸润和神经细胞损伤, 可能通过抑
28、制氧自由基的 生成及蛋白激酶C的活化l2 。其具体的机制有待进 一步研究。 本实验结果提示, 米诺环素可能具有抑制大鼠脑 缺血再灌注后细胞间勃附分子 1 表达的作用, 阻断他 们引起的血管内皮细胞与白细胞的勃附, 抑制中性粒 细胞的浸润, 从而减少神经元的损伤, 起到一定的脑保 护作用。本实验丰富了米诺环素的作用机制, 为临床 应用提供了依据。 参考文献 1 Sta p f C , Mo h e J P . I s c h e m ic: t r o k et h e r a p y J . A n n uR e vMe d , 2 0 0 2 , 5 3: 4 5 3 一 4 7 5 2 G
29、 o l u bL M, R a mam u rt b yN S , Mc N a m a r aT F , e t a l . T e t r a c y c l i n e s i n h i b i t con n ect i v e t i : s u eb r e a k d o w n ; n e wt h e r a p e u t i ci m p l icat io n s fo r a no l dfa m i l yo f d r u g s J . C r i t R e v o r s l Bio I Me d , 1 9 9 1 , ( 2 ) : 2 9 7 一
30、3 2 2 . 3 A m in A R, T h akk erM G , P a t elP D , etal . An o ve l m ec h a ni s mo f a 山。 ofyt et rac州in es: ef feCt s o ni tr ico x i d e sy nt h 份 J . P rDc N at1 A “ 记 阳 U S A. 1 9 9 6 , ( 9 3 ) : 1 4 0 1 4 一 1 4 0 1 9 . 4 毛 昭 丫 D , C h o i H , C 肠 面O R C , etaL洲曰胡der, 硒n oc y c l inein hi bit
31、 口 n t u 成 听 t d gger edm i t oc油n d r i司c 外 仪坛 姗 e c 记easea n d而ti gat es l u n ct io n 习d eficits after示耐 cordinjur妊J .P r OC N atl A c a d豁 U S A, 2 0 0 4 , 1 0 1: 3 0 7 1 一 3 0 7 6 . 5 Z e a lo n g a E L , we i n s t e i n P R , C a r l s o nS , e t a l . K e u e r s i b l e m id d l e c e r e b
32、 r a l a rt e r y occ l u s i o n w i t h o u t c r a i n i e c t o m y i n r at J j . S t r o k e , 1 9 8 9 , 2 0 : 8 4 . 6 wa n gX , S i r e nA L , L i uY, c t a l .U p r e g u l a t io no f i n t e rc e l l u l a r a d h e s i o nmo l e c u l el ( I C A M一 1 ) o nb rai nm i e r o v a s e u l a re
33、 n dot h e l i a l c e l l s i nr ati s c h e m i a c ode x J . B r a i n R e s Mo I B r a i n R e s , 1 9 9 4 , 2 6 ( 1 / 2 ) : 6 1 一 6 8 7 S t a n i m i r o v i c D ,S h a p i ro A ,W O n gJ , e t al .T h ei n d u c t i o nof I C A M 1i nh u m a nc e r e b r o mi c v a s c u 1 a r e n d o t h e l
34、i a l c e l l sb yi sch e - m i少 l i k e c o n d t io np r o mot e s e n h a n c e dn e u t rop h i l / H C E Cadh e s i o n J . J N e u r o i mm u n o l , 1 9 9 7 , ( 1 / 2 ) : 1 9 3 一 2 0 5 . 8 Bow e :MP , Z i v i nJ A, R o t h l e icR . Mo n o c lo n a l a n t i b o d yt ot h e ICA M一 1a d h e s
35、i o ns i t er e d u c e sn e u ro l o g i c a l dam a g ei nara b b i t c e r e b ra l e m b o l i s m s t rok em ode l J , E x pN e u rol ,1 9 9 3 ,1 1 9 : 2 1 5 一 2 1 9 , 9 Z h a n g R L , C h o p pM, C h e nH, e l a l . T e m 阳r a l p ro fi l e o f i s c h e - m i c ti s s u e 山m 眼e , n e u t roP
36、 h il re s p o n s e , a n dv a s c u l a r p l u 韶1 咚 fo l - l o w i n g , p e m l a n e n t a n dt ra n s i e n t m id d l ec e r e b ra l a rt e r yo “ l u s i o n i n t h e r a t J j . N e u r o l sci , 1 9 9 4 , 1 2 5 ( 1 ) : 7 6 一 7 5 . 1 0 j C h e n C C , R o s e n b l o o mC L , A n d e r s
37、o n I X 二 , e t a l . Sel e c t i v e i n h i b i - t i o no f Ds e l e c t i n, v a s c u l a rc e l l a d h e n s i o nn 1 O l e c u l e-1a n di n t e r - 沈l l u 1 a r a d h e n s io nmo 1 e c u l e le x p r e s s i o nb yi n h i b i t o r so f k a p p a Ea l p l ap h o s p h o r y l a t io n J j . Jl m m u n o l , 1 9 9 5 , 1 5 5 ( 7 ) ; 3 5 3 8 - 3 5 4 5 . 1 1 吴珊, 董为伟, 董佑忠. 局灶性脑缺血再灌流后 IcA M一 1 表达与 白细胞浸润 J. 中风与神经疾病杂志, 2 o 00, 17: 5 一 7. 1 2 熊燕, 贺智敏.四环素抑制活化的内皮细胞表达粘附分子【 J . 中国药理学通报. 2 0 0 2 , 1 8 ( 1 ) : 2 8 一 3 1 .( 收稿2 0 0 8 一 0 1 一 1 5 ) 万方数据
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