糖基化终产物对人肾系膜细胞趋化因子RANTES表达的影响.pdf
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1、现代医学( M o d e mM e d i c a lJ o u m a l ) ,2 0 0 9 年6 月,第3 7 卷第3 期 糖基化终产物对人肾系膜细胞趋化 因子R A N T E S 表达的影响 论著 马丽1 ”,孙子林1 ,王少华1 ( 1 东南大学附属中大医院内分泌科,江苏南京2 1 0 0 0 9 ;2 武警南京消防医院内科,江苏南京2 1 0 0 0 8 ) 摘要 目的探讨糖基化终产物( A G E s ) 对人肾系膜细胞( H R M c ) 趋化因子R A N T E s 表达的影响。方法常规 方法制备糖基化终产物( A G E s B s A ) ,干预体外培养的H R
2、 M c ,收集培养上清和细胞,E L I s A 法检测上清中R A N T E S 浓 度,实时定量R T - P c R 检测R A N T E Sm R N A 表达水平,w e s t e mb l o t 检测R A N T E s 蛋白表达,分别设立同浓度的B s A 组 及空白对照组作为对照。结果A G E s - B s A 干预组H R M cR A N T E sm R N A 和蛋白表达水平及上清中R A N T E s 浓度明 显高于对照组,并存在浓度和时间依赖效应。结论A G E s - B s A 上调H R M cR A N T E S 表达和分泌,可能参与糖尿
3、病肾 病的发生。 关键词 糖基化终产物;人肾系膜细胞;正常T 细胞表达分泌的调节趋化蛋白 中图分类号 R - 3 3 ;R 5 8 7 1 文献标识码 B 文章编号 1 6 7 卜7 5 6 2 ( 2 0 0 9 ) 0 3 0 2 0 9 一0 3 近年来趋化因子与糖基化终产物( a d v a n c e dg l y c o s y l a t i o ne n dp r o d u c t s ,A G E s ) 在介导糖尿病肾病( d i a - b e t i cn e p h m p a t h y ,D N ) 发病中的作用日渐得到人们的 关注,我们前期研究观察到糖尿病患者
4、血清A G E s , 尤其是小分子的糖基化终产物一肽( A G E s p e p t i d e s , A G E - P ) 、C C 亚族趋化因子单核细胞趋化蛋白l ( m o n o c y t ec h e m o a t t r a c t a n tp m t e i n l ,M C P 一1 ) 和正常T 细胞表达分泌的调节活化蛋白( r e g u l a t e du p o na c t i v a - t i o n ,n o 肌a lTc e Ue x p r e s s e da n ds e c F e t e d ,R A N T E S ) 均 显著高于
5、正常对照,且与糖尿病肾病发生发展相关nJ 。 本研究旨在细胞水平观察A G E s 对人肾系膜细胞( h u - m a nr e n a lm e s 粕西a lc e l l s ,H R M C ) 表达R A N T E s 的影响, 为进一步阐明D N 的发病机制提供新的理论依据。 l 材料和方法 1 1 材料 1 1 1 细胞株人肾系膜细胞( H R M c ) 株,由阮雄中博 士( R e 脚U m t ,R o y a lF 慨H o s p i t a l ,k n d o n ,U l ( ) 惠赠。 1 1 2 试剂牛血清白蛋白( B S A ) ,D M E M 培养基
6、,新 生小牛血清,高纯度R N A 提取试剂盒和L i g I l t C y c l 矗7 艟 F 鹪t 8 t a nD N AM a s t e rS Y B RG r e e nI 试剂盒( 德国罗氏) , S u p e r s c r i p t l M R N a s eH 一逆转录试剂盒( 美国I n v i t m g e n ) 。m N T E s 及c y c l o p h i l i n 引物由德国I n t e r a c t i v a 合 成,人R A N ,m S9 6 孔E U S A 试剂盒( 法国I m m u n o t e c h ) , 作者简介
7、 马丽( 1 9 7 5 一) ,女,北京人,主治医师,医学硕士。 通讯作者 孙子林,E m a i l :8 u m i l i n y a I l c n R A N r I E s 小鼠抗人单克隆抗体I g G ( R & D ) ,E r k 小鼠抗 人单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记兔抗小鼠I g G ( 美国S a n t aC r u z 公司) ,B C A - 1 0 0 蛋白质定量测定试 剂盒,P v D F 膜( 德国罗氏分子生化) ,化学发光底物和 增强剂( 美国P i e r c eP i c o ) ,x 线胶片( 柯达) 。 1 1 3 仪器和器材 C O :恒温培
8、养箱( N A P C O ) , L i g h t c y c l e r 实时P c R 仪( 德国罗氏) ,S c R 一3 0 0 电泳仪 ( 上海万达生物工程公司) ,紫外检测仪( 天能科技有 限公司) ,洗板机( M o d e l l 5 7 5 ,B I O R A D 产品) ,酶标仪 ( M o d e l5 5 0 ,B I O R A D 产品) 。 1 2 方法 1 2 1 A G E s - B s A 的制备在p H7 4 的P B s 溶液里 加入B s A ,使浓度为5 0g L ,然后加入葡萄糖使其 终浓度为5 0m m o 卜L ,过滤除菌后3 7 无菌
9、孵育。 使用前以p H7 4P B s 溶液透析除去未结合的葡萄糖。 对照组B s A 中不含葡萄糖,其余条件一致。 1 2 2 H R M C 的培养加入含1 0 小牛血清的 D M E M 培养液,置于3 7 、5 C O :的饱和湿度培养箱 中,隔日换液,每3d 以1 :2 传代1 次。 1 2 3 H R M c 的干预将处于对数生长期的m 珊c 移 人6 孔板中,待细胞长到次融合状态( 细胞计数约为2 1 0 6 ) 后换用无血清D l 怔M 培养2 4h ,然后分组干预:( 1 ) 用同一浓度( 4 0 0I l l g L 。1 ) 的A G E - B S A 干预6 、1 2
10、 、2 4 、 4 8h ,以同浓度B s A 组作为对照;( 2 ) 以不同浓度( 5 0 、 万方数据 2 l O 现代医学( M o d e mM e d i c a lJ o u m a l ) ,2 0 0 9 年6 月,第3 7 卷第3 期 1 0 0 、2 0 0 、枷、8 0 0 嘴L “) 的A G E B S A 干预H R M C4 8h , 以空白对照组作为对照。 1 2 4实时定量R T P C R 检测细胞R A N T E Sm R N A 的表达按照试剂盒说明书进行总R N A 的提取、 c D N A 逆转录合成及P c R 反应。c y c l o p h
11、i l i n 的引物:上 游5 一A T G G T C A A C C C C A C C G T G T 一37 ,下游5 - G A C A A G G T C C C A A A G A C A G C A G 一3 ,R A N T E S 的弓I 物:上 游5 一A T G A A G G T C T C C G C G G C A C G C C T C - 3 ,下游5 一 C T A G C T C A T C T C C A A A G A G T T G A T 一3 。P C R 反应条 件:9 5 1 0s ,6 0 5s ,7 2 1 0s ,共5 0 个循环。实
12、 时定量P C R 结束后对其融解曲线进行分析。 1 2 5E L I s A 法检测细胞培养上清中R A N T E s 水平 按照试剂盒说明书进行。 1 2 6W e s t e mb l o t 检测R A N T E S 蛋白表达 培养的 H R M c 经改良的R I P A 裂解缓冲液提取。提取物在冰 上孵育3 0m i n ,4 1 20 0 0r m i n 。1 离心2 0m i n ;上清 液中的蛋白浓度经B c A 法定量。上清液稀释1 倍,煮 沸5m i n 。以半干电转移恒流0 8A c m 2 转移3 0m i n 。 5 P B s T B S A 封闭1h 。R
13、 A N T E S 小鼠抗人单克隆抗 体I g G 配成l :5 0 0 浓度,4 孵育过夜。P B s T 缓冲液 充分洗膜后膜与l :20 0 0 辣根过氧化物酶标记的兔抗 小鼠I g G 在室温下摇荡孵育lh ,再次充分洗膜后运用 P i e r c eP i c o 化学发光液孵育5m i n 。X 线胶片成像。 以E r k 作为内参,R A N l E S 条带密度与E r k 条带密度 的比值作为各组实验数据,每组实验重复3 次。 1 3 统计学处理 数据以面s 表示,所有数据均使用蹦s m3 0 统 计软件进行单因素方差分析。 2 结果 2 1 A G E - B s A 干
14、预不同时间对H R M CR A N T E S m R N A 、蛋白水平及培养液上清R A N T E s 浓度的影响 以4 0 0m g L - 1A G E - B S A 对H R M C 分别干预6 、 1 2 、2 4 、4 8h ,R A N T E Sm R N A 、蛋白水平和上清中R A N - T E s 浓度均明显高于相应B s A 组,呈随时间延长逐步 升高趋势。见表l 。 表lA G E - B S A 影响R A N l 【 E Sm R N A 和蛋白水平及上清R A N T E S 浓度的时间效应( 面s ) 与B s A 组比较,P O 0 5 ,P O
15、0 1 2 2不同浓度A G E B S A 对H R M CR A N T E Sm R N A 及 蛋白水平影响 在基础状态下,H R M c 微量表达R A N l r E Sm R N A ( O 0 2 2 0 0 1 ) 及蛋白( O 1 1 0 1 ) ,上清中有蛋白 ( 1 8 0 2 8 2 9 ) p g I I l l 1 分泌。在4 8h 内,随着A G E - B S A 的干预浓度不断升高( 5 0 、1 0 0 、2 0 0 、4 0 0 、8 0 0m g L - 1 ) ,R A N T E sm R N A 水平、蛋白表达及上清中的蛋白 分泌呈逐步升高趋势。
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