紫杉醇、5-氟脲嘧啶抑制肝癌细胞BEL-7402生长和诱导凋亡的比较.pdf
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1、收稿日期:2005_02_22 基金项目:广东省医学科研基金(A2002880) Supported by Medical Science Foundation of Guangdong Province (A2002880) 作者简介:余元龙(1964_),男,硕士,副主任医师 紫杉醇、5_ 氟脲嘧啶抑制肝癌细胞 BEL_7402 生长和诱导凋亡的比较 余元龙 1,季明芳2,何洁冰2,李晓玲2(1 中山市人民医院普外科,广东中山528403;2中山市肿瘤研究所,广东中 山528400) 摘要:目的 研究紫杉醇、5_氟脲嘧啶(5_Fu)抑制肝癌细胞BEL_7402增殖和诱导凋亡的效果。 方法
2、采用ATP生物发光 法检测肝癌细胞株的药物敏感性,以流式细胞术、形态学方法分析细胞凋亡和细胞周期。结果BEL_7402对紫杉醇高度 敏感,对5_Fu低度敏感,抑制作用均存在剂量、时间效应。 紫杉醇组3种浓度诱导细胞凋亡率均明显高于无药对照组 (P ?=-$%+:- To investigate the effect of paclitaxel and 5_flurouracil (5_Fu) on growth inhibition and apoptosis of human hepatoma BEL_7402 cells. A-%6/ paclitaxel; 5_fluorouracil;
3、 apoptosis 抗癌药物对肿瘤产生的效果不仅在于对肿瘤细 胞增殖的抑制,同时在于诱导肿瘤细胞的凋亡。 能否 诱导肿瘤细胞凋亡成为评价抗癌药物疗效的重要标 志。紫杉醇(paclitaxel,商品名Taxol)是一种促进细胞 微管聚合、抑制微管解聚的新型抗肿瘤药,目前临床 上已应用于治疗卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌,而 对肝癌的治疗还在试验研究阶段 。5_氟脲嘧啶 (5_fluorouracil ,5_Fu)是临床常用的肝动脉或门静脉 插管灌注化疗药物。 本研究采用ATP 生物发光法进 行肿瘤化疗药敏试验 (tumor chemosensitivity assay, TCA)、 以流式细胞
4、术检测肝癌细胞BEL_7402对紫 杉醇、5_ Fu的敏感性,报道如下。 1 材料与方法 1.1 研究对象 人肝癌细胞株BEL_7402由广东省药学院黄树 林教授赠送。RPMI1640培养基和胰蛋白酶均为 GIBICf产品。ATP_TCA试剂盒为德国DCS公司产 品,包括:包括完全分析培养基(CAM)、肿瘤组织解 离酶、ATP抑制剂、ATP提取液、 荧光素 _荧光素酶 检测试剂等。Annexin g为美国Caltag公司试剂盒。 化疗药物:紫杉醇(Pac,北京四环医药)、5_Fu (上海旭 东海普公司)、丝裂霉素(MMC,日本协和发酵工业)、 表阿霉素(EPI, 法玛西有限公司)、10_羟基喜
5、树碱 (HCPT,黄石飞云制药)、顺铂(DDP,云南个旧生物 制药)。 1.2 方法 第一军医大学学报(J First Mil Med Univ) 2005;25(7)864 -20 0 20 40 60 80 100 200100502512.56.25 % test drug concentration (TDC) % Tumour Growth inhibition EPI DDP 5-FU PAC MMC HCPT 图1 BEL7402细胞药物剂量-抑制曲线 Fig.1 Dose-response urves of BEL-7402 ell PAC: Paclitaxel; 5-Fu:
6、 5-fluorouracil; MMC: Mitomycin; DDP: Cisplatin 表1 药物培养24 h的细胞凋亡率 Tab.1 Ratio of apoptosis of BEL-7402 after ultured for 24 h with two drugs(%, MeanSD) Group TDC(%) 02550100 PAC12.026.0025.8312.8522.7113.7120.7712.80 5-Fu12.026.0047.715.7451.8510.46 55.3713.80 1.2.1 肝 癌 细 胞 株 培 养在 含10%小 牛 血 清 的 RPMI
7、1640培养液中,37 、5% CO2中培养。 培养瓶 壁贴满细胞时,0.25%胰蛋白酶消化,收集细胞,制成 单细胞悬液。 1.2.2 ATP 生物发光法进行TCA试验 参照文献3。 1.2.3 流式细胞术(FCM)检测紫杉醇、5-Fu处理下细 胞凋亡情况在24孔培养板中加入试验药物、CAM 和肿瘤细胞悬液, 药物终浓度分别为100%、50%、 25%TDC,设无药对照孔。 在上述条件下培养至24、 48、72 h后收集细胞,并制成单细胞悬液,1 000 r/min 离 心6 min, 弃 上 清 液 ,4 的PBS洗2次 , 按 Annexin-V试剂盒说明操作。 用于凋亡峰及DNA倍 体
8、分 析 的 细 胞100% 测 试 药 物 浓 度 (test drug conentration, TDC)紫杉醇和100% TDC 5-Fu )用 70 % 的乙醇固定,充分混匀,4 过夜,上机前用冷的PBS 洗两次, 其余步骤按试剂说明进行。FCM为美国 COULTER-XL临床型。 1.3 统计分析 采用SPSS10.0软件,显著性比较采用t检验。 2 结果 2.1 肝癌癌细胞株BEL-7402 7种化疗药物带药培养 培养至第6天时,无药对照孔ATP荧光值17 258, CV值8.77%。 药敏结果显示:细胞对紫杉醇、10-羟 基喜树碱高度敏感,对5-Fu低度敏感,对丝裂霉素、 表阿霉
9、素和顺铂均为耐药。 药物抑制曲线下面积 (AUC)依次为紫杉醇 10-羟基喜树碱5-Fu 表阿 霉素顺铂丝裂霉素(图1)。 紫杉醇的IC50和IC90 的TDC分 别 为 :3.51% (5.5810-7 mol/L)、12.88% (2.0510-6 mol/L),5-Fu的IC50和IC90的TDC分 别 为: 34.66% (6.7910-5 mol/L )、73.45% (1.44-4 mol/L)。 2.2 化疗药物处理下的细胞早期凋亡 培养24、48、72 h,Annexin V实验显示两种药物 均以24 h凋亡率最高, 紫杉醇组凋亡率随药物浓度 下降而升高, 且凋亡率在培养的三个
10、时段均比同级 TDC的5-Fu组低。5-Fu组细胞凋亡率随药物浓度升 高而增加(图2)。 紫杉醇组中100%TDC孔凋亡率最 低,仍高于对照组(t=3.09, P00) Fig.3 Morphylogi al hanges of BEL7402 ells treated by PAC and 5-Fu for 96 h(Origin67 86gni9i:6;i00) ?= ?A gr00E FGAHI B= 5-FU gr00EFGAHI A= A00 )有7个 左右贴壁细胞细胞,大部分细胞皱缩,见少量细胞碎 片。 96 h:光镜下观察见紫杉醇组无贴壁细胞,50E以 上细胞肿胀、大、圆、透亮,
11、有若干细胞成团现象,且不 悬浮、 移动, 见细胞碎片, 悬浮细胞比5-FB少 (图 3?),5-FB组未见贴壁细胞,细胞固缩、体积变小呈圆 形,细胞质内颗粒明显,细胞碎片多(图3B)。 无药对 照组细胞贴壁生长,分裂细胞较多(图3A)。 3 讨论 3K 肝癌细胞株对紫杉醇、5-FB的敏感性 紫杉醇是微管系统的稳定剂,使细胞分裂阻断在 L2MNO期。 由于其独特的作用机制且高效低毒,成 为近十年来抗肿瘤药物中最受重视的一类新药。紫杉 醇对肝癌细胞的作用尚存争议。 本实验中BEL-7402 细胞株对紫杉醇高度敏感,药物抑制-剂量曲线显示 死亡细胞率随药物浓度增加而升高,呈剂量效应。 根 据我们的药
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