糖皮质激素在MCAO大鼠海马神经元凋亡中的作用及健脑安干预的研究.pdf
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1、第2 2 泰第5 期 2 004年 5月 中 C H I N E S E A R C H I V E S 日 乏宵学 OF TR A DI T I ON A L 刊 CHI NE S E Vo l M月 y 2 2 No . 5 2004 国家自然科学基金资助项目( 3 0 2 7 1 6 2 4 ) 糖皮质激素在M C A O大鼠海马神经元 凋亡中的作用及健脑安干预的研究 魏翠矛 白 1田金洲1 a . 北京东 直门医 院老年 病科, 1 0 0 0 7 0北京; 2 . 北京中 医药大学. 白晶 “唐一鹏2 1 0 0 0 2 9 , 北京 / / 第一作A 女, 1 9 7 4 年生,
2、2 0 0 1 级博 册 究 生) 摘要: 目的 观察脑故血再灌注后2 4 h内的内源性据皮质漱素对海马种经细胞凋亡的形响及中药对此 的干预。方法: 应用天脑中动脉阻盆( M C A O ) 模型, 采取甲苯按兰、 T U N E L和免疫组化实验方法, 动态观察 脑缺血再灌注后2 4 h内的内源性据皮质漱素对大鼠海马神经细胞凋亡的影响及中药对此的+预。结果: T U N E L P a 性细胞从再灌注2 h 开始表达, 再灌注6 h P a 性细胞表达继续增加 再淮注1 2 h 达高 峰, 再灌注2 4 h 下降。治疗组、 对照组、 拮杭荆组与模型组在再灌注各时点均有显著性差别( P 0 .
3、 0 5 , ) , 其中治疗纽和桔 杭荆 组差 异 极皿著( 尸 0 . 0 1 ) 0结 论: 健R 3 安可有效 抑钊脑缺 血再灌 注2 4 内 , 内 源性祷皮 质激素对海马 神 经元的促凋亡作用。 关镇 词: 据皮质激素;M C A ( 大复海马 神经元凋 亡;健脑安干预的研充 中图分类号: R 一 3 3文献标识码: A文童纬号: 1 0 0 9 一 5 2 7 6 ( 2 0 0 4 ) 0 5 一 0 8 1 2 一 0 3 8 1 2 脑缺血和缺血再灌注后引发的血浆、 海马高糖皮质 激素( g l u c o c a rt ic o i d s , G C S ) 可加重脑缺
4、血再灌注后的神 经细胞 死亡 卜 4 1 。 有研究者认为高G C S 诱导神经细胞 死亡的主要形式是细胞调亡(3 ,6 1 。对干脑缺血再灌注后 G C S与脑缺血再灌注后的神经细胞凋亡的关系, 多侧 重于探讨高G C S和海马内脑缺血再淄注后海马C A l 区 神经细咆的延迟性死亡, 而对于再灌注2 4 h以内G C S 对神经细胞训亡的影响研究较少。本实验应用G C S 拮 抗剂( R U一 4 8 6 ) 和补肾活血化痰中药( 健脑安) , 采取甲 苯胺兰, T U N E L 和免疫组化实验方法, 观察脑缺血再灌 注后2 4 h 内的内源性糖皮质激素对海马神经细胞凋亡的 影响及中药对
5、此的干预, 进一步完善内源性糖皮质激素 在缺血性卒中中作用机制, 为卒中后神经细胞保护药物 开发提供一定的实脸依据和参考。 1 材料与方法 实L 材朴实验动物: 健康2 级S D 雄性大鼠6 0 只, 体重3 0 0 - 3 2 0 g , 由 北京维通利华动物中心提供。适应 性饲养1 周后 动物随机分为假手术组( S h a m ) , 模型组 ( M o d e l ) , 拮抗剂组 一 R U 4 8 6 ( R U ) 组、 治疗组( 健脑安 组) 、 对M组( 都可喜组) 。每组依再灌注时点分为2 h , 6 h , 1 2 h , 2 4 h 4 个时点, 每个时点3 只. 每组1
6、 2 只大鼠 。 主要药 物与试荆 健脑安由河南苑西制药有限贵任 公司供给。都可喜法国施维亚药厂生产。米非司酮 ( R U 4 8 6 ) 由北京紫竹药业公司生产。 T U N E L 试剂盒由 法国R u c h e 公司生产。糖皮质激素受体( 9 l 。 二。 rt im i d r e c e p t o r , G R ) 免疫组化试剂盒由夭津派洋生物制品公司 提供。 实 脸方法 给药方法: 假 手术 组给 予0 . 7 m V I O O g 体 重/ d 灌服燕馏水。对照组予都可喜7 . 3 9 m g / k g / d , 2 5 m g 加 入1 0 0 - 1 燕馏水中,
7、以。 . 7 i n 1/ l 0 0 g 体重, 灌胃给药。 治疗组根据课题组前期实验工作, 选取健脑安中剂云组 为给药组, 于造模7 天前予6 . 7 g 生药/ k g / d , 0 . 7 m 1八O O g 体重, 遭胃给药。拮抗剂组在造模前, 天, 给予米非司酮 ( R U 一 4 8 6 ) 1 0 以k g / d , 0 . 7 - 1/ l 0 0 g 体重给药。 棋 型 制 各 参 照K o iz u m i 等 7 l 和N e g a s a w a 等 s 方 法制成大脑中动脉阻塞( M C A O ) 模型。假手术组麻醉 后, 结扎C C A后缝合。不予进栓线,
8、 ( 假手术组的设立是 用以评测手术过程是否对实验结果存在干扰。 ) aft织I4 1 定f.取材予1 0 % 水合氯醛( 0 . 3 m l / k g 体 重 腹腔麻醉大鼠, 麻醉后从左心室插管灌注, 先予0 . 9 % 生理盐水5 0 m l 灌注后, 行4 %的多聚甲 醛灌注2 5 m i n , 注 毕取出大脑 并置于4 % 多聚甲醛液中 后固定过夜。 免疚组化实脸方法 按照试剂盒中实验步骤进行操 作, 阴性对照片中以P B S 代替G R 一抗。 原位末端标Z ( T U N E L ) 实Ll11jw采用末端标记 脱氧核昔酸M T酶) 介导的d U T P 缺口 末端标记( T
9、d T 一 m e d ia t e d d U T P n ic k e n d l a b e li n g , T U N E L ) 法标记神 经元凋亡细胞核中的D N A 3 一 ( ) H末端。每一组标本 取6 个不同 样本的切片, 每个样本选取切片各2 张。按 照T U N E L 试剂盒中的操作步骤操作。 统 计 及 分 析 O l y i m p u s 真彩图 像 分析 仪( 日 本) , 美 国I m a g e 一 P -分析软件 进行图像分析。 光镜1 0 x 2 0 倍 下随机选取3 个视野, 对A亡阳性细胞分布区域, 数量进 行采集和图像分析、 作半定量侧定, 以
10、数面密度( 单位面 积内的调亡阳性细胞数) 为计量值。用S P S S I 0 . 0分析 结果. E x c e ll 作图表。 2 结果 甲笨胺蓝桑色结果 假手术组海马神经细胞排列整 齐, 细胞形态规整, 胞浆均匀, 脑组织神经细胞结构正常, 尼氏小体请楚, 呈斑块或顺粒状。再灌注2 h 棋型组、 治 疗组、 阳性对照药组和拮抗剂组各组的海马神经细胞无 明显异常。再灌注6 h 各组在C A 2 和齿状回区出现不同 程度的形态学改变 以模型组神经元损伤最为明显, 镜下 可见, C A 2区和齿状回的神经细胞呈现不同程度的核皱 中居药李刊 万方数据 第5期 魏草相: 糖皮质嵌素在MC A O大
11、鼠海马种经元凋亡中的作用及健脑安干预的研究 缩, 胞 浆颜色变浅 尼氏小体 形态模糊或消失, 部分细胞细胞 颜色为淡黄色 阳性面积小, 散在分布在海马各区 体积变小。治疗组、 阳性对照药组和拮扰剂组海马神经模型组再灌注2 h 抓伤侧海马C A 2 和齿状回有散在的棕 细胞损伤, 均较模型组轻. 细胞核无明显的固缩表现。再黄色阳性细胞出现, 较假手术组71 .m 亡细胞无明显的区别 灌注抢h 损伤神经细胞增多, 部分细胞脱失。再灌注再灌注6 h 出现棕黄色渭亡阳性细胞表达增多, 表达部位 2 4 h 时组间神经细胞的尼氏 体变化差异最明显。损伤神以 在C A 2 和齿状回较多, C A 3 区的
12、锥体细胞层也有分 经细胞分布区域, 除海马 C A 2区和齿状回外, C A I 和布。再灌注1 2 h 损伤侧海马凋亡细胞在各实验组C A 2 , C A 3 区神经细胞也出现尼氏 体消失的改变。神经细胞损C A 3 和齿状回 均增多, 损伤侧与健侧对比 极其明显。再 伤程度以 拮抗剂组最小, 其次为健脑安组, 阳 性对照组较灌 注2 4 h 阳性细胞分布在C A I 一C A 4 及齿状回区。但 拮抗剂组和对照组模型重, 但较模型组海马损伤轻。提C A 3 阳 性细胞颜色较再灌注6 h 和 1 2 h 浅。在再灌注 示三种药物对脑缺血再灌注后的海马神经元, 有不同程6 h , 1 2 h
13、, 2 4 6 中以 模型组的凋亡阳性细胞最多, 拮抗剂组 度的保护作用。凋亡细胞最少, 治 疗组次之, 对照组凋亡细胞数介于治疗 G R 免疫组化衣达部位各实验组的G R表达部位组和模型组之间。T U N E L 阳性细胞从再灌注2 1, 开始 较为一致, 均主要集中在海马C A 1 , C A 2 和齿状回。G R表达, 再灌注6 h 阳性细胞表达继续增加, 再灌注 1 2 h 达 阳性表达为细胞核和胞浆均有棕黄色颗粒。再灌注2 h ,高峰. 再灌注2 4 h 下降。统计学分析结果表明, 治疗组、 再灌住6 h 、 再滋注1 2 h 和再灌注2 4 h 4 个时间点, G R表对照组、 拮
14、抗剂组与模型组在再灌注各时点均有显著性 达的解剖部位无明显改变。差别( P 0 . 0 5 1 ) , 其中治疗组和拮抗剂组差异极显著 T U N E L 结果阴性片镜下为均匀一致的背景色,( P 0 . 0 1 ) . 无阳 性细胞的表达。 光镜下假手术神经细胞有少员调亡 表 1脑缺血再油注后海马T U N E L 的表达结果 T a b le 1 E x p r e s s io n o f T U N E L In h ip p o c a m p u s a ft e r c e r e b r a l Is c h e m la r e p e r hu s io n in t h
15、e d iff e r e n t g r o u p s ( R t S , n = 6 ) 一, , - , . . . . . . S h a m Ma d e l C o n r rol c r - e n l R U R2 h R6 h R1 2 h R2 4 h 0 . 4 0 4 2土0 . 0 7 4 0 . 4 4 8 3士0. 0 7 4 0 . 4 7 0 1 士0. 0 4 5 0. 4 6 9 8士0. 0 3 4 0. 5 91 4士0. 0 5 1 0. 6 9 1 5土0 0 . 7 7 4 5 土0 0 . 6 7 4 0上0 0 . 5 2 4 7 士 0
16、. 0 4 9 二 0 . 6 1 6 3 土0 - 0 5 2 “, 0 . 6 7 2 0 士 0 . 0 7 6 0 0 . 4 4 8 3 土 0 . 0 3 6 “ “ 0 - 5 1 3 7 士 0 . 0 6 5 # 0 . 6 0 3 3 0 . 0 3 2 0 . 0 旧士0 . 0 7 5 0 . 5 7 8 8土n . 0 2 8: : : : 0 . 5 0 9 4 士0 . 0 6 6 # 0 . 5 5 5 5 0 . 0 6 8 # # 0 . 6 1 3 6 - 0 . 1 4 2 # # 。 . 5 艾 36 士 00 7 刃# 064069057 中医药 8
17、 1 3 粤刊 N o t e : + v s s h a m g ro u p P 0 . 0 5 , . * v s s h a m g ro u p P 0 . 0 1 , 特a s m o d e l g ro u p P 0 . 0 5 . 林林 v s m o d e l g ro u p P 0 . 0 1 3 讨论区 和齿状回的神经细胞呈现不同程度的核皱缩, 胞浆颜 实验结果显示, 甲笨胺蓝和T U N E L 结果都存在一色变浅. 尼氏小体形态模糊或消失o T U N E L染色呈现 定的时相变化。T U N E L阳性细胞从再灌注2 h 开始表出散在棕黄色凋亡阳性细胞, 表
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