系统低温生物学技术在实验小鼠资源保存中的建立与应用.pdf
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1、2 0 0 9 年8 月 第1 9 卷第8 期 中国比较医学杂志 C H I N E S EJ O U R N A LO FC O M P A R A T I V EM E D I C I N E A u g u s t ,2 0 0 9 V 0 1 1 9N O 8 系统低温生物学技术在实验小鼠资源保存中的 。 建立与应用 徐平1 2 ,刘丽均3 ,郁丽丽3 ,贾青k 4 ,高 娟1 4 ,杨博L 5 ,陈浩杰h 6 ( 1 中国科学院上海生命科学研究院,上海2 0 1 6 1 5 ;2 国家啮齿类实验动物种子中心上海分中心; 3 上海斯莱克实验动物有限责任公司;4 南京农业大学;5 西北农
2、林科技大学;6 沈阳农业大学) 【摘要】 目的建立小鼠胚胎与配子冷冻库,以安全、有效地保存小鼠资源。方法选择不同遗传背景( 近交 系、远交群、免疫缺陷、疾病模型和基因改变等) 的实验小鼠,系统进行了超数排卵、体外受精( F ) 率、胚胎与精子 的冷冻复苏效果、卵巢冷冻与移植、辅助体外受精等比较研究。结果小鼠年龄和遗传背景的不同,其超数排卵 的结果也不同( P 0 0 5 ) 。对玻璃化方法保存1 3 年的胚胎进 行复苏,并与冷冻保存1 3 0d 的胚胎复苏率进行 抽样比较,结果证明保存时间对胚胎的复苏率基本 没有影响( P 0 0 5 ) r 1 5 1 6 。 4 小鼠精子的冷冻保存 4 1
3、 遗传背景对小鼠精子冷冻的影响 采用小鼠精子冷冻、冻融精子体外受精的方法, 探究不同遗传背景小鼠精子的冷冻效果。选用同一 周龄( 1 5 周龄) 五种不同品系小鼠K M 、I C R 、C 5 7 B L 6 J 、D B A 2 J 和B a l b c A ,分别进行精子冷冻、复苏,比 万方数据 1 2中国比较医学杂志2 0 0 9 年8 月第1 9 卷第8 期C h i nJC o m p M e d ,A u g u s t2 0 0 9 ,V 0 1 1 9 N o 8 较各品系小鼠冻融精子的活力、前向运动的百分比。 结果显示:各品系小鼠间新鲜精子的活率均在7 6 8 6 ( + +
4、 + 。+ + + + ) 之间,前向运动精子百分比为 3 7 。4 8 ,均差异无显著性( P 0 0 5 ) 。冷冻、复 苏后有部分精子存活并保持前向运动的能力,但精 子的活率和运动速度都明显下降,5 个品系小鼠冻 融精子的平均前向运动百分率分别为:K M 为 3 9 7 、I C R 为1 9 6 、D B A 2 J 为4 6 2 、C 5 7 B L 6 J 为2 5 6 、B a l b c A 为2 4 4 ,各品系间差异显著( P 0 0 5 ) ;2 0 周龄雄鼠交配前后的精子冷冻复 苏率分别为2 6 和4 9 ,交配后的冷冻效果较好 ( P O 0 5 ) 。所得的基因工程
5、 小鼠后代,经P C R 检测,与原小鼠一致( 图3 ,4 ) 。卵 巢移植的G F P 小鼠,超排、体外受精后,胚胎荧光检 测有明显的绿色荧光( 图5 ) 。用移植卵巢的子鼠进 行交配,产子后子鼠在荧光显微镜下有部分为荧光 小鼠,部分为受体残存卵巢排卵的后代( 图6 ) 。也 证明胚胎的来源是G F P 小鼠“ ( 图1 6 见封二) 。 6 小鼠的辅助体外受精技术 单精注射技术是目前治疗男性不育的最佳选 择汹】。在动物方面利用单精注射已经产生后代的 动物包括小鼠2 川,金黄地鼠引、大鼠圳、兔、牛川、 羊蚓、马蚓、猫圳、猪圳和猴驯。 由于C 5 7 B L 6 小鼠及以其为背景的基因工程小
6、鼠较低的冻融精子的体外受精率而影响了这些重要 品系的保存,本实验室采用I C S I 技术,对C 5 7 B L 6 J 和I C R 小鼠的冻融精子进行了I C S I 实验,并比较 I C S I 和F 的受精率和胚胎发育率。结果显示, C 5 7 B L 6 J 同I C R 冻融精子的I C S I 受精率较高,分别 为9 4 和9 5 ,两品系间差异不显著( P 0 0 5 ) 。 分别与同品系冻融精子的F 受精率相比,差异均 有极显著性( P 0 0 5 ) ,但显著均低于I C R 小鼠I C S I 和F 两种受精 方式的囊胚发育率( P 0 0 5 ) 。 7结束语 由于胚胎
7、、配子和生殖器官等的低温保存具有 ( 1 ) 不需要对动物进行饲育管理;( 2 ) 减轻动物在饲 育空间上的压力;( 3 ) 维持经费大幅度减少( 胚胎冷 冻的维持费是常规饲育方法的I 1 0 左右,精子冷冻 是常规饲育方式的1 3 0 左右) ;( 4 ) 不会引起基因的 突变或飘变;( 5 ) 因火灾、地震等自然灾害引起的”全 军覆灭”的可能性很小;( 6 ) 不需要担心病原体的感 染等。因此它是目前为止实现实验动物资源保存的 最为有效的方法。世界上一些发达国家以此方法建 立起了各自的实验动物胚胎冷冻库。我国近1 0 年 在该领域的研究上发展迅速,国家啮齿类实验动物 种子中心上海分中心在实
8、验动物生殖工程和低温生 物学方面已开展了系统性研究并建立了相应的技 术,并正在建立啮齿类实验动物的冷冻胚胎库。 参考文献: 1 徐平实验动物胚胎和配合子的低温保存 J 中国实验动物 杂志,2 0 0 0 ,1 0 ( 4 ) :2 4 0 一2 4 4 2 C f i t s e r ,M o b r a a t e nL E C r y o p r e s e r v a t i o no fr o u t i n es p e r m a t o z o a J I L A RJ 2 0 0 0 ,4 “4 ) :1 9 7 2 0 6 3 G a t e sA H M a x i m i
9、 z i n gy i e l da n dd e v e l o p m e n t a lu n i f o r m i t yo fe g g s M i n :w H F r e e m a n ( e d ) ,M e t h o d si nM a m m a l i a n E m b r y o l o g y S a nF r a n c i s c o ,C A ,1 9 7 6 ,6 4 7 6 4 S o n g s a s e nN ,蹦b oS P C r y o p r e s e r v a t i o no fn l t O l l s p e r m a t
10、 o z o a R e l a t i o n s h i pb e t w e e n s u r v i v a la f t e r c r y o p r e s e r v a t i o n a n do s m o t i c t o l e r a n c eo fs p e r m a t o z o af r o ms t r a i n so fm i c e J c r y o b i o l 0 科,1 9 9 7 , 3 5 :2 2 5 2 6 9 5 S u g i y a m aF K a j i w a r aN H a y a s h iS e ta 1
11、 D e v e l o p m e n to fi n o u a a c y t e ss u p e m v u l a t e da td i f f e r e n ta g e s J L a bA n i m a lS c i ,1 9 9 2 。 4 2 ( 3 ) :2 9 7 2 9 8 6 徐平不同1 3 龄小鼠的超排、体外受精及2 细胞胚胎移植的 比较研究 J 实验生物学报,2 0 0 1 ,3 4 ( 3 ) :2 5 3 2 5 5 7 赵丹凤,刘丽均,赵立虎。等不同遗传背景小鼠的超排与 体外受精率的比较研究 J 上海交通大学学报,2 0 0 6 ,2 4 ( 5
12、) :4 6 5 4 7 0 8 W i l m u tI T h ee f f e c to fc o o l i n gr a t e w a r m i n gr a t e ,c r y o p r o t e c f i v e a g e n ta n ds t a g eo fd e v e l o p m e n tO I Is u r v i v a lo fi n o u g ee m b r y o sd u r i n g f r e e z i n ga n dt h w i n g J L i f eS e i ,1 9 7 2 ,1 1 :1 0 7 1 1 0
13、7 9 9 陈大元主编受精生物学一受精机制与生殖工程 M 科学 出版社。北京:2 0 0 0 3 1 6 3 5 7 I o 】徐平,山村绫子,唐一岷,等不同品系小鼠的体外受精、胚 胎冷冻及移植的比较研究 J 中国实验动物学报2 0 0 4 ,1 2 ( 3 ) :1 4 7 1 5 1 1 1 N a k a g a t aN C r y o p r e s e r v a t i o no fI n o u t t es p e r m a t o z o a J M a m m G e n o m e ,2 0 0 0 ,11 :5 7 2 5 7 6 1 2 陆晔,唐一岷,刘丽均,等不
14、同小鼠品系精于冷冻及冻融 精子外受精率的研究 J 上海交通大学学报,2 0 0 3 2 1 ( 增 刊) :6 9 1 3 中泻直己。超急速冻结法老用k 、把体外受精由来7 哆灭2 细 胞期胚刀冻结保存I :一) L 、r J 日本不妊学会杂志,1 9 8 9 , 3 4 :4 7 0 4 7 4 1 4 徐平,川I 野佳代刘丽均等实验大鼠、小鼠胚胎的缓慢冷 冻和玻璃化冷冻的比较 J 上海交通大学学报,2 0 0 2 。2 0 ( 4 ) :2 6 1 2 6 5 1 5 刘丽均,顾坚忠,朱冬琴,等不同品系小鼠胚胎玻璃化冷 冻保存的比较研究 J 中国实验动物学报,2 0 0 2 1 0 ( 2
15、 ) :7 7 万方数据 1 4 中国比较医学杂志2 0 0 9 年8 月第1 9 卷第8 期C h i nJC o m pM e d ,A u g u s t2 0 0 9 ,V 0 1 1 9 N o 8 ( 上接第4 页) 因的转录下调的原因,也很可能与M V 5 是一种限制 性培养基,并非是一种丰富的培养基,总体来讲,其对 细菌的生长的能源提供不是一种相对过剩的状态,在 这种情况下,副溶血弧菌为了节能,这些相关的基因 的转录下调也就是一种合理的整体调控需要。 总之,我们的研究表明牛磺胆酸可以促进蛋白 质合成和含硫氨基酸以及谷氨酸等相关基因的转录 上调,同时牛磺胆酸也可以诱导一些膜稳定和
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- 系统 低温生物学 技术 实验 小鼠 资源 保存 中的 建立 应用
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