精原干细胞移植及体外培养研究进展.pdf
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1、收稿日期 2005 -08 -02 基金项目 国家自然科学基金 (30200195) ; 全军医药卫生科 研基金资助项目 (01MA204) 作者简介 李恩中 (1971 - ) , 男, 河南省驻马店市人, 黄淮学 院讲师, 在读博士生, 研究方向: 精原干细胞的研 究及应用。 *通 讯 联 系 人,E-mail:enzhongli hotmail. com;Tel: 010- 66931009 精原干细胞移植及体外培养研究进展 李恩中,李德雪*,张世庆,王常勇 (军事医学科学院基础医学研究所, 北京 100850) 摘要 精原干细胞 (spermatogonial stem cells,
2、SSCs) 移植是近年来发展起来的一项技术, 是将供体动物 (正常动 物或转基因动物) 的 SSCs 移植到受体动物的睾丸内, 使其在受体睾丸内迁移、 定居、 增殖并启动精子发生, 产生有 受精能力精子的过程。该技术在雄性不育的治疗、 精子发生机制的探讨、 干细胞生物学研究以及优质动物或转基 因动物繁育等方面具有广阔的应用前景。SSCs 的体外培养是制约该技术发展的瓶颈。近年来, 许多研究者报道了 SSCs 体外培养的影响因子及其生长特点。本文就近年来 SSCs 的体外培养及移植的研究进展作了概要评述。 关键词 精原细胞; 干细胞; 移植; 体外培养 中图分类号 Q813. 7;R321. 1
3、文献标识码 A 文章编号 1000-5501 (2006) 03-0280-04 Spermatogonial stem cells transplantation and culture: a research progress LI En-Zhong,LI De-Xue*,ZHANG Shi-Qing,WANG Chang-Yong (Institute of Basic Medical Sciences,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850,China) Abstract Spermatogonial stem cells
4、(SSCs)transplantation is a novel technique developed in recent years,in which the testicular cell suspension from donor animals(normal or transgenic animals)is microinjected into seminiferous tubes at the surface of the host testis,and subsequently,the donor SSCs survive,migrate,proliferate, initiat
5、e the spermatogenesis and produce the sperms with normal fertilization ability in the host testis. This technique provides a new opportunity for therapy of sterile male,study of spermatogenesis mechanism and production of transgenic animals. However,these applica- tions are restricted by the in vitr
6、o culture of SSCs. In recent years, research into effects of cytokines on proliferation of SSCs were reported. Here the advances in SSCs culture and transplantation are reviewed. Key words spermatogonia; stem cells;transplantation;culture 干细胞的分裂包括增殖型分裂和分化型分裂, 前者可维 持自身群体恒定, 后者可产生终末分化细胞, 自增殖和分化 潜能是干细胞
7、最根本的生物学特征。精原干细胞 (spermato- gonial stem cells, SSCs) 位于动物睾丸曲细精管基膜上, 能够 通过自增殖维持自身群体, 又能定向分化为各级生精细胞直 至精子, 因此说 SSCs 既具有干细胞最根本的生物学特性, 又 是生物体内能将遗传信息传递给后代的唯一成体干细胞。 自 Brinster 等 1, 2报道 SSCs 异体 (种) 移植成功以来, SSCs 逐 渐成为干细胞领域内一个新的研究热点。若将 SSCs 的分离 培养、 冷冻保存、 转基因或基因打靶等技术结合起来, 必将为 精子发生机制研究、 濒危物种保存、 优质动物繁育、 转基因或 基因剔除
8、动物制作、 男性不育的治疗以及人类某些遗传疾病 的基因治疗提供一种强有力的生物学工具。本文根据相关 研究报道, 结合本实验室多年的工作, 对 SSCs 的体外培养、 应用及发展前景等作了总结与评述。 1 精原干细胞的应用 1. 1 精原干细胞移植及其应用 1994 年, Brinster 等 1, 2将可育小鼠的混合生精细胞显 微注射到不育小鼠曲精小管内, 结果来自供体小鼠的 SSCs 在受体小鼠睾丸内成功迁移、 定居、 增殖, 并产生了正常的精 子。1996 年, Clouthier 等 3又完成了 SSCs 的跨物种移植, 他 们将大鼠生殖细胞植入免疫缺陷小鼠的曲细精管, 结果小鼠 睾丸内
9、产生了大鼠精子。之后, 该技术引起了研究者广泛的 兴趣, 在很多动物中进行了尝试。近年来, 研究者对灵长类 (包括人) SSCs 的异体、 异种移植进行了研究 4 6, Reis 等5 将人生殖细胞移植到免疫缺陷小鼠睾丸, 发现人生殖细胞未 能存活, 他们认为, 人生殖细胞与小鼠曲细精管体细胞之间 的组织不相容性导致了移植细胞的死亡; 而 Nagano 等 4发 现, 狒狒的 SSCs 在小鼠睾丸内能存活 6 个月, 之后他们又将 人生殖细胞植入小鼠睾丸, 结果表明, 移植后第 1 个月细胞 仍能进行分裂, 第 2 个月细胞数量明显减少, 3 个月后只有 082 军事医学科学院院刊 2006
10、年 6 月 第 30 卷 第 3 期 Bull Acad Mil Med Sci,Jun 2006; Vol 30 No 3 As 和 Apr 型细胞存活, 但不能进行进一步的分裂、 分化 6。 这一结果说明, 种内或种间移植后, 只有精原干细胞能被受 体睾丸支持细胞识别迁移至曲细精管基膜, 成功占据 niche, 并能维持一定时间的分裂能力。 SSCs 移植时, 供体和受体动物的选择是重要的。为减 轻移植排斥, 一般选用免疫缺陷小鼠作受体, 多采用显微操 作, 将来自供体的含有 SSCs 的生殖细胞注射到小鼠曲精小 管内。可以在被移植的细胞悬液中加入台盼蓝, 用以指示注 入情况。为便于移植结
11、果的鉴定, 常用内源性精子发生过程 障碍或人为破坏生精细胞的动物作移植受体。研究表明, 注 射一定剂量的白消安 (甲磺酸丁二醇二酯) 或照射一定剂量 的 X 射线即可破坏内源性生精细胞; 也可以选择基因突变 小鼠, 如 W/ Wv(white spotting locus,W) 或 SL/ SLd(steel lo- cus,SL) 突变小鼠作为移植受体, 前者缺少 SSCs, 后者由于 支持细胞缺陷而造成内源性生精作用缺失 7。 SSCs 移植在基础研究及农、 医领域都具有重要的应用 价值, 而且得到了广泛研究。将性成熟前小鼠的睾丸细胞冻 存, 复苏后移植, 结果成功完成了精子发生 8。这些
12、技术可 用于物种的保存, 即将濒危动物的 SSCs 冷冻保存, 可以即时 利用合适宿主睾丸恢复该物种的精子发生。近年来, 有人将 睾丸组织异位移植, 如移植到受体动物皮下或睾丸囊下, 产 生了供体动物雄性配子 9 12。Ohta 等12将此方法所获圆 形精子细胞注射到卵母细胞内, 再植入假孕鼠输卵管, 结果 产生了仔鼠。甚至睾丸组织冷冻保存后移植也能启动生精 过程 10。从操作难度来看, 睾丸组织移植比 SSCs 移植更容 易。然而, SSCs 移植有其不可替代的作用, 若将肿瘤患者化 疗前的 SSCs 取出冻存, 化疗后回植, 即可治疗化疗引起的男 性不育。 SSCs 移植也为干细胞 nic
13、he 的研究提供了有效手 段 13, 14, 虽然曲细精管内存在多层不同分化类型的细胞, 但 SSCs 可以通过细胞层及支持细胞间的紧密连接, 迁移至 niche 并定居。SSCs 之间相互竞争 niche, 随着动物年龄和睾 丸的生长, SSCs 和 niche 的数量均增加 13, 14。因此, 移植也 为干细胞与其 niche 间关系的研究提供了手段。移植后也只 有精原干细胞能够成功迁移、 定居、 增殖, 而其他阶段的生殖 细胞却被排出曲细精管, 所以移植技术现已发展为 SSCs 鉴 定及功能分析的一种方法; 还有人以此来富集精原干细 胞 15。另外, SSCs 移植还可用于探讨雄性不育
14、症发生的原 因等, 例如将正常动物的生精细胞移植到 Jsd (juvenile sper- matogonial depletion, 原始精原细胞缺失)动物, 结果 Jsd 动 物产生了供体动物的精子 16, 说明 Jsd 动物不育的原因在 于生精细胞的缺乏, 而不在于生精过程的病变。 目前, SSCs 移植的应用仍有很大的局限性, 还需更进一 步的研究。大鼠或仓鼠的 SSCs 移植到小鼠睾丸后能完成生 精过程 3, 17, 但与小鼠亲缘关系较远的动物, 如兔和狗、 猪、 牛和马以及灵长类作为供体时, 供体 SSCs 在小鼠睾丸内虽 能成功迁移、 定居等, 但不能完成生精过程, 其分裂只限于
15、精 原细胞阶段 4, 6。 1. 2 转基因及基因剔除研究 SSCs 移植技术还可用于生产转基因或基因剔除动物, 转基因动物的生产主要通过显微注射法、 ES 细胞法和精子 载体法完成。显微注射法需要专门设备及操作人员, ES 细 胞法只在小鼠中较为成熟, 精子载体法在子代中产生转基因 附加体的比率较高。SSCs 是成体内唯一能向子代传递遗传 信息的干细胞, 因此对其进行基因转移、 修饰或剔除, 就能通 过 SSCs 分化产生的精子生产转基因或基因剔除动物。与显 微注射法、 ES 细胞法和精子载体法等相比, 该方法具有简便 易行、 转染效率高等优点, 具有更广阔的应用前景。向 SSCs 导入外源
16、基因的方法很多, 近年来, 运用逆转录病毒载体或 慢性病毒载体感染 SSCs 18 20, 然后再进行移植生产转基因 动物, 收到了良好效果。2004 年, Kubota 等 21利用 SSCs 介 导, 成功生产了携带绿色荧光蛋白基因的转基因小鼠, 运用 相似的方法可以生产基因剔除动物。技术成熟时, 还可以将 外源基因导入 SSCs 或剔除其某一基因, 再将该 SSCs 体外诱 导分化出精子, 将这种携带外源基因或基因剔除的精子注入 卵细胞, 再植入假孕鼠子宫, 生产转基因及基因剔除动物。 2 精原干细胞的体外培养 以上所述 SSCs 的应用大多需将其进行较长时间的体外 培养甚至建系, 获得
17、更多、 更纯、 生物学上更安全的 SSCs, 以 提高移植后的克隆效率和安全性。因此, SSCs 体外培养及 建系的研究一直受到该领域研究者的重视。SSCs 体外培 养, 一般采用 DMEM 或 DMEM/ F12 作为基本培养基, 再添加 一些生长因子 (GF) , GF 为 SSCs 自增殖所必需 21。多年 来, 本实验室在小鼠 SSCs 培养方面作了大量的工作, 主要探 讨了干细胞因子 (SCF) 、 白血病抑制因子 (LIF) 、 碱性成纤维 细胞生长因子 (bFGF) 以及温度等对 SSCs 体外培养的影响, 阐明了 34 37最适合 SSCs 的体外生长, 其中 37更适合 于其
18、增殖型而非分化型分裂; SCF 和 bFGF 能刺激 SSCs 分 裂, 但 SCF 主要是引起分化型分裂 22 24。 SCF 是 c-Kit 受体的配体, 由 Steel 位点 (steel locus,SL) 编码; c-Kit 是一种酪氨酸激酶受体, 由位于小鼠第 5 染色体 的 W 位点 (white spotting locus,W) 的原癌基因 c-kit 编码。 SCF/ c-Kit 系统对雄性生殖细胞的存活起着非常重要的作 用 22 25。据报道, SCF 与其受体 c-Kit 结合后, 能刺激靶细 胞 DNA 合成, 促进其增殖。然而, 受体 c-Kit 主要表达于 Ley
19、ding 细胞以及晚期 Aal至 B 型精原细胞, 在 As、 Apr和早期 Aal中不表达 26。因此, SCF 对 SSCs 的增殖型分裂 (自增殖) 并无多大积极作用, 我们实验室的工作也证实了这一点 24。 但 Abe 等 27报道, 重组人 SCF 能促进 SSCs 增殖型分裂。 成纤维细胞生长因子 (FGFs) 属于肝素结合蛋白家族, 参与很多生理过程, 报道表明, FGFs-1, -5, -8, -10, 和-14 在大 鼠及小鼠睾丸均有表达。FGFs 发挥作用的途径之一, 是通 过酪氨酸激酶受体 (FGFRs) 增强 MAPK 活性, 从而启动多种 生理功能, 包括细胞有丝分裂
20、 28。 LIF 含 180 个氨基酸, 核心蛋白相对分子质量为 20 103, 有 7 个糖基化位点, 6 个 Cys, 能抑制小鼠胚胎干细胞的 分化, 我们发现 LIF 同样也能够抑制 SSCs 的分化 24。人和 小鼠 LIF 基因分别定位于第 22 号和第 11 号染色体, 基因长 度分别为 6. 0 kb 和 6. 3 kb, 均含有 3 个外显子和 2 个内含 子, 基因编码区高度保守, 其同源性在 78% 94%。LIF 受 182 军事医学科学院院刊 2006 年 6 月 第 30 卷 第 3 期 体具有 2 个亚单位, 链为低亲和力受体, 其结构属于红细 胞生成素受体家族成员
21、。Gp130 和 链共同组成高亲和力 受体, LIF 受体分布于脂肪细胞、 成骨细胞、 神经细胞、 胚胎 癌细胞、 胚胎干细胞等。另外, 人重组 LIF 也能促进 SSCs 增 殖 29。 胶质细胞源神经营养因子 (glial cell line-derived neuro- trophic factor,GDNF) 是转化生长因子- 家族的一个远房成 员。其信号转导受体复合体包括 GDNF 家族受体-1(GFR- 1) 和酪氨酸激酶 Ret 受体 30 35, GFR-1 通过糖基磷脂酰 肌醇 (GPI) 与膜结合, 同时与 Ret 相互作用。睾丸中, GDNF 由支持细胞分泌 34 36,
22、 而 GFR-1 受体则表达于未分化的 精原 细 胞 32, 35。研 究 表 明,GFR-1 受 体 由 SSCs 表 达 21, 32, 37, 但尚待进一步证实。还有研究表明, GDNF 能维 持体外培养时生殖细胞的干细胞特性 38, 并能促进 SSCs 分 裂 32。Kanatsu-Shinohara 等37研究发现, 在无滋养层的情 况下, 只有在培养液中添加 GDNF 时, SSCs 才能增殖。可 见, GDNF 是调节 SSCs 自增殖的关键因子之一。 另外, 激素在 SSCs 体外培养中的作用也有很多报道, 卵 泡刺激素 (FSH) 、 雌二醇 (E2) 、 睾酮 (T) 等与
23、 SSCs 的体外存 活增殖有关 39, 40。研究表明, 10 pg/ ml 的 E 2足可诱导鳗鲡 SSCs 的体外自增殖, 而其受体拮抗剂 他莫西芬 (tamox- ifen) 起抑制作用 39; FSH 在成体精原细胞发育调节中可能 作为有丝分裂原, 主要促进分化型而非增殖型分裂, 因此, FSH 能促进 SSCs 的分化, 而不是自增殖; 睾酮在 SSCs 的分 裂及隐睾动物生精作用恢复中起一定作用 40。 精原细胞体外培养建系, 早在 20 世纪 60 年代就开始了 尝试, 但由于分离纯化等困难, 再加上一些体液因子对精原 细胞的作用尚未阐明, 因而进展不大。1980 年, Mat
24、her 建立 了睾丸上皮细胞系, 但该细胞系不能进行减数分裂而形成精 子。1991 年, Haneji 等培养了隐睾小鼠睾丸, 研究了 A 型精 原细胞的分化及其生精能力的恢复。Hofman 等用 SV40 大 T 抗原感染小鼠睾丸, 获得了介于 B 型精原细胞与初级精母 细胞之间的细胞系; 后来又用 SV40 大 T 抗原基因和编码 P53 的温度敏感性突变体的基因共转染小鼠原代细胞, 获得 了 2 个生殖细胞系, 但是这些细胞系并不具有干细胞特征, 体外也未能分化为精子。2002 年, van Pelt 等也通过 SV40 大 T 抗原基因转染而成功建立大鼠精原干细胞系, 该细胞系 表达干
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