糖皮质激素对内毒素致急性肺损伤大鼠肺组织FRACTALKINE表达的影响.pdf
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1、糖皮质激素对内毒素致急性肺损伤大鼠肺组织 F r a c t a l k i n e 表达的影响 王蕾1,李廷谦1,向国霞1,王刚2 1 .四川大学华西医院 中西医结合科(成都6 1 0 0 4 1 ) ;2 .四川大学华西医院 呼吸内科 【摘要】 目的动态观察内毒素( L P S )所致急性肺损伤( a c u t el u n gi n j u r y ,AL I )大鼠肺组织内趋化因子 F r a c t a l k i n e ( F KN)的表达变化,及糖皮质激素对其的影响。方法将4 2只大鼠随机分为空白对照组、模型组( L P S ) 及地塞米松干预组( D E X ) ,其中L
2、P S组和D E X组再分为1h 、 2h 、 4h3个时相组,每组6只, L P S组和D E X组大 鼠经尾静脉注射L P S ( 4mg / k g )建立AL I大鼠模型。采用E L I S A、 R T- P C R等方法,观察AL I大鼠模型肺组织病理 学改变、肺湿干重比值( W/ D )及血清T NF - 变化,并检测肺组织F KNmR NA的表达,同时观察地塞米松对上述指 标的影响。结果模型组1h 、 2h与4h3个时相组肺损伤病理改变、肺W/ D 、血浆T NF - 均明显增高,地塞米松能 减轻AL I大鼠肺组织炎症反应、肺W/ D值及血清T NF - 水平( P均0 . 0
3、 5 ) 。正常大鼠肺组织F KN mR NA有表 达,模型组3个时相亚组肺组织F KNmR NA表达较正常组明显增加( P0 . 0 5 ) ,在2h时点达峰值,地塞米松能下 调AL I大鼠肺组织F KNmR NA表达( P0 . 0 5 ) 。F KNmR NA的表达量与血清T NF - 水平呈正相关( r =0 . 6 7 4 , P0 . 0 5 ) 。结论 早期应用地塞米松可降低T NF - 水平,下调肺组织F KN mR NA的表达,这可能是糖皮质激素 对内毒素致急性肺损伤实验大鼠保护作用机制之一。 【关键词】 急性肺损伤肿瘤坏死因子- F r a c t a l k i n e糖
4、皮质激素 【中图分类号】 R 5 4 1 . 6 3 E f f e c t o fD e x a me t h a s o n eo nE x p r e s s i o no fF r a c t a l k i n ei nL i p o p o l y s a c c h a r i d e - i n d u c e dA c u t eL u n gI n j u r y WA N G L e i ,L | i - q i ,X A N GG u o - x i ,WA N GG . De p a r t me n t o fR e s p i r a t o r yMe d i
5、c i n e ,We s t C h i n aHo s p i t a l , S i c h u a nUn i v e r s i t y ,C h e n g d u6 1 0 0 4 1 ,C h i n a 【 A b s t r a c t 】 O b j e c t i v e T oi n v e s t i g a t et h ee f f e c t o f d e x a me t h a s o n eo nt h ee x p r e s s i o no f f r a c t a l k i n e( F KN)i n l i p o p o l y s a
6、 c c h a r i d e( L P S ) - i n d u c e da c u t el u n gi n j u r y ( AL I ) .Me t h o d s T h er a tmo d e l o fAL Iwa se s t a b l i s h e db y i n j e c t i o no f L P Sa t t h ed o s eo f 4mg / k g .4 2Wi s t a r r a t s we r er a n d o ml yd i v i d e di n t ot h en o r ma l g r o u p( n =6 )
7、,L P S g r o u p( n =1 8 ) ,a n dd e x a me t h a s o n e( D E X)g r o u p( n =1 8 ) ,a n dt h e nt h er a t si nb o t hL P Sa n dD E Xg r o u p swe r e d i v i d e di n t ot h r e e s u b g r o u p s ( 1h ,2ha n d4ha f t e r i n j e c t i o no f L P S ) ,r e s p e c t i v e l y .T h e p a t h o l o
8、 g i c a l c o n d i t i o na n d t h ewe t / d r yr a t i o( W/ D )o f t h el u n gwe r eo b s e r v e d ,a n ds e r u m T NF - l e v e l ,a n dF KN mR NA o f t h el u n gwe r e d e t e c t e dwi t hE L I S A a n dR T- P C R .R e s u l t s T h eW/ D ,s e r u m T NF - l e v e l ,a n dF KN mR NA o f
9、t h el u n gwe r e s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e di nL P Sg r o u p ,c o mp a r e dwi t ht h o s ei nn o r ma l g r o u p( a l l P0 . 0 5 ) ,b u t t h eW/ D ,s e r u m T NF - l e v e l ,a n dF KN mR NA o f t h el u n gi nt h eD E Xg r o u pwe r emu c hmo r ed e c r e a s e dt h a nt h o s
10、 ei nt h eL P S g r o u p( a l l P0 . 0 5 ) .I na d d i t i o n ,t h ee x p r e s s i o no f F KN mR NA i nt h el u n gt i s s u ep o s i t i v e l yc o r r e l a t e dwi t ht h e c o n c e n t r a t i o n o fT NF - ( r = 0 . 6 7 4 , P 0 . 0 5 ) .C o n c l u s i o nT h ef i n d i n g ss u g g e s t
11、e dt h a tp r e - t r e a t me n twi t h d e x a me t h a s o n ec o u l di n h i b i tt h eT NF - l e v e l a n dp r e v e n tt h ei n c r e a s eo ft h ee x p r e s s i o no fF KN mR NA,wh i c h ma yb eo n eo f t h eme c h a n i s msb ywh i c hD E Xs e r v e sa sap r o t e c t i o na g a i n s t L
12、 P S - i n d u c e dl u n gi n j u r y . 【 Ke yw o r d s 】Ac u t el u n gi n j u r yT u mo rn e c r o s i sf a c t o r - F r a c t a l k i n eD e x a me t h a s o n e 脂多糖( l i p o p o l y s a c c h a r i d e ,L P S )是内毒素的 主要成分,在L P S引起肺的急性炎症反应中, L P S 通过损伤肺血管内皮细胞、激活白细胞、与巨噬细胞 表面受体结合、促进氧自由基及多种炎症介质的释 放
13、 等 途 径 诱 发 急 性 肺 损 伤( a c u t el u n gi n j u r y , AL I ) 1 。多器官功能障碍综合征( mu l t i p l eo r g a n d y s f u n c t i o n s y n d r o me ,MOD S )或 多 器 官 衰 竭 ( mu l t i p l eo r g a nf a i l u r e ,MOF )往往是AL I恶化加 重并发多脏器严重损害的结果 2 。因此,积极防治 AL I是阻止病情进一步发展变化的重要环节。 F r a c t a l k i n e ( F KN)作为趋化因子C X 3
14、C家族的 唯一成员,是一个含有3 7 3个氨基酸残基的蛋白质 C o r r e s p o n d i n ga u t h o r 分子。 F KN对于炎症细胞在血管壁上的募集和内皮 细胞的损伤具有重要作用 3 , 4 。L P S所致的AL I涉 及到炎症细胞的募集、血管内皮细胞损伤以及肺血 管通透性增加等变化,因此我们推测F KN可能参 与了AL I的发生发展。 1 对象与方法 1 . 1 动物及分组 Wi s t a r大鼠4 2只,雌雄不限,体质量( 2 0 8 2 3 )g ,由四川大学实验动物中心提供。随机分为空 白组,模型组( L P S组) 1h 、 2h 、 4h3个时相
15、组和地 塞米松干预组( D E X组) 1h 、 2h 、 4h3个时相组,共 7组,每组6只。 1 . 2 方法 四 川 大 学 学 报(医 学 版) JS i c h u a nU n i v( Me dS c i E d i ) = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = 2 0 0 6 ;3 7 ( 2 ) : 2 5 02 5 3 1 . 2 . 1 AL I模型的制
16、备及给药方法D E X组与 L P S组大鼠于造模前2h分别腹腔注射地塞米松 ( 5 0mg / k g )或生理盐水2mL 。除空白组外, D E X与 L P S组均在实验时尾静脉注射L P S ( 4mg / k g , 美国 S i g ma公司) 制备AL I大鼠模型 5 。所有动物均严格 于设定时相点采集标本。 1 . 2 . 2 组织学检查取右肺上叶肺组织甲醛固定 2 4h ,石蜡包埋切片, HE染色,由病理科医生在普通 光学显微镜下观察,参照人肺损伤程度分级标准,判 定肺损伤程度。 1 . 2 . 3 肺组织湿干质量比值( W/ D )测定取左肺 叶称湿质量后,至干燥箱( 8
17、0, 2 0h )烤至恒重,称 干质量,计算肺湿干比值。 1 . 2 . 4 血清 T NF - 测定 经颈动脉采血1mL , 8 0 0r / mi n 8mi n ,吸取上清,置-2 0冰箱保存待 测。采用双抗体夹心AB C - E L I S A法,严格按照试剂 盒(美国S i g ma公司)说明书操作。 1 . 2 . 5 R T- P C R检测F KN mR NA表达水平 参 照有关文献,检测步骤如下: 肺组织总R NA提取 与 定 量:取 右 肺 下 叶 8 0mg匀 浆,采 用 一 步 法 ( T AKAR Ao n es t e pR NAP C Rk i t大连宝生公司)
18、提取总R NA,紫外分光光度计测定R NA含量; R T- P C R :F KN 上游引物为: 5 - C AT C AT C C T G G AG AC G AG AC - 3 ,下游引物为: 5 - AC T G AG G G AT G G AC T G T G C - 3 ,可扩增长度 为 6 6 6b p ; 肌 动 蛋 白( - a c t i n )上 游 引 物: 5 - T G T C C C T G T AT G C C T C T G G T C G T A- 3 ,下 游 引 物: 5 - C AG C AC T G T G T T G G C AT AC T AG G
19、 T C - 3 , 可扩增长度4 7 9b p 。所有引物均由上海基康公司 合成。根据试剂盒(成都博瑞克生物技术有限公司) 说明,逐一加入试剂及2 g总R NA,总反应体积为 5 0 L 。互补脱氧核糖核酸( c D NA)合成和预变性: 5 0逆转录1 5mi n , 9 4, 2mi n进行1次循环。 P C R扩 增: 9 4 3 0s ,5 7( F KN)或6 7( - a c t i n )退火1mi n , 7 2延伸1 . 5mi n ,共3 2个循 环;最后以7 2延伸8mi n 。 F KNmR NA表达水 平的半定量检测:取 F KN及 - a c t i n扩增产物1
20、 0 L在2 0g / L琼脂糖凝胶中, 1 0 0V电泳2 0mi n , 凝 胶 电 泳 图 像 输 入 Ko d a kD i g i t a lS c i e n c eS y s t e m D C 2 4 0凝胶成像系统,应用图像分析软件进行各条 带平均灰度值分析,以同时扩增的 - a c t i n为内参 照,用F KN/ - a c t i n扩增产物的比值表示转录因子 相对表达量;R T- P C R产物鉴定:将R T- P C R产 物纯化后,用AB I P R I S M 3 7 7全自动测序仪测序, 并与G e n B a n k基因序列比较。 1 . 2 . 6 统计
21、学方法所有实验测定值以 x - s表 示,计量资料进行单因素方差分析,等级资料进行秩 和检验。以直线相关分析参数间的相关性, =0 . 0 5 。 2 结果 实验动物尾静脉注射 L P S后,均出现呼吸急 促,口唇发绀,精神萎靡,少动少食,尤以L P S组各 时相点明显,而D E X组表现相对较轻,持续时间较 短,表明AL I造模成功。在实验所设定的各时相点 所有动物均存活。 2 . 1 病理学观察 大体观察:正常对照组肺组织呈白色略红,组织 柔软有弹性; L P S1h组肺上即观察到充血、水肿, 表面偶见散在瘀点; 2h组见肺表面呈暗红色,明显 充血水肿,可见片状瘀斑及出血灶; 4h组肺大体
22、情 况与2h组相似。 D E X组大体观察较L P S组同时相 点有不同程度减轻。 光镜观察:正常对照组肺组织结构清晰,肺泡壁 薄,肺间质无炎性细胞浸润,肺泡内无渗液,无红细 胞; L P S1h组见肺间质水肿、增宽,炎性细胞浸润; 2h组肺损伤最明显, 可见肺间质明显增宽、渗出、 水肿,透明膜形成,肺泡出血,大量炎性细胞浸润; 4 h组肺损伤程度与2h组基本相同;D E X组光镜下 肺损伤程度较L P S组相同时点均有不同程度减轻, 见表1 、图1 。 2 . 2 肺湿/干重比值( W/ D )变化 L P S组各时相点肺W/ D均明显高于正常对照 组( P0 . 0 5 ) ;D E X组
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- 糖皮质激素 对内 毒素 急性 损伤 大鼠 组织 FRACTALKINE 表达 影响
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