红色毛癣菌对抗真菌药物的敏感性与种株特异性的关系.pdf
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1、1 3 6 第 二 军 医 大 学 学 报 A c a dJS e c M i l M e d U n i v 2 0 0 6F e b ;2 7(2) 专题报道 红色毛癣菌对抗真菌药物的敏感性与种株特异性的关系 朱红梅, 温 海*, 廖万清( 第二军医大学长征医院皮肤性病科, 上海2 0 0 0 0 3) 摘要 目的:探讨红色毛癣菌对抗真菌药物的敏感性与其种株特异性之间的关系。方法:采用微量稀释法, 检测红色毛癣 菌对7种临床常用抗真菌药物的敏感性, 并对红色毛癣菌的基因型、 表型、 分离部位等与对抗真菌药物的敏感性进行相关性研 究。结果:不同基因型、 表型及不同部位分离的红色毛癣菌菌株对特
2、比萘芬、 萘替芬、 伊曲康唑的M I C值范围较集中( 分别为 0. 0 1 60. 0 3 2、0. 0 3 20. 0 6 3、0. 2 51g/m l) , 且前两者的M I C值更小( 众数均为0. 0 3 2g/m l) , 而对酮康唑和氟康唑的 M I C值范围则相差较大( 分别为0. 2 52、13 2g/m l) 。W i l c o x o n秩和检验显示, 红色毛癣菌对特比萘芬、 萘替芬、 伊曲康 唑、 两性霉素B等4种抗真菌药物的M I C与基因型、 表型、 分离部位的不同无显著相关。结论:红色毛癣菌对抗真菌药物的 敏感性可能与基因型、 表型或分离部位无关。 关键词 红色
3、毛癣菌; 基因型; 表型; 敏感性; 抗真菌药 中图分类号 R3 7 9. 2;R9 7 8. 5 文献标识码 A 文章编号 0 2 5 8 - 8 7 9 X(2 0 0 6)0 2 - 0 1 3 6 - 0 4 ? % A # ) A ( * # . % + B % + g e n o t y p e;p h e n o t y p e;s u s c e p t i b i l i t y;a n t i f u n g a l a g e n t A c a dJS e cM i lM e dU n i v, 2 0 0 6,2 7(2) :1 3 6 - 1 3 9 作者简介 朱红
4、梅, 博士, 讲师. E - m a i l:h m z h uc ny a h o o . c o m. c n *C o r r e s p o n d i n ga u t h o r . E - m a i l: w e n h a i 9 8s o h u. c o m 浅部真菌病是皮肤科的常见病、 多发病, 皮肤癣 菌是浅部真菌病的主要致病菌。目前虽已开发了很 多新的口服和外用抗真菌药物, 而合理选择使用抗 真菌药物, 特别是对甲真菌病等一些周期长、 费用高 的浅部真菌病的治疗, 具有重要意义。我们采用微 量稀释法, 对最重要的浅部病原真菌, 也是最大的一 类 皮 肤 癣 菌- -
5、 -红 色 毛 癣 菌 (T r i c h o p h y t o n r u b r u m) 进行了种内基因分型, 并就菌株的基因型、 表型、 分离部位等与对抗真菌药物敏感性的关系进 行了相关研究。 1 材料和方法 1. 1 实验菌株 红色毛癣菌临床分离株2 0株, 来 自上海华山医院真菌室,标准株1株, 来自本院真 菌室。菌株分离部位:R 3、 1 7( 面部) ;R 1 2、1 6、2 5( 颈 部) ;R 2 0( 耳 垂 部) ;R 4、1 5( 上 肢) ;R 1 1( 下 肢) ; R 1 0、1 3、1 8、1 9、2 7( 股部) ;R 1、2、9、2 4( 足趾、 足
6、缝) ;R 1 4、 2 1( 腰部等其他部位) 。将菌株进行初步 鉴定, 并分表型: 羊毛型( 6株,R 1 3、1 5、1 7、2 0、2 4及 标准株) 或绒毛型( 4株,R 1 8、1 9、2 5、2 7) , 粉末型(6 株,R 3、 4、1 0、1 1、1 2、2 1) 或沟纹型(2株,R 1、2) , 颗 粒型( 2株,R 9、1 6) , 混合型(1株,R 1 4) 。 1. 2 试 剂 培 养 基: 沙 氏 葡 萄 糖 蛋 白 胨 琼 脂 ( S D A) 、 马铃薯葡萄糖琼脂(P D A) 、 尿素琼脂培养 基、R PM I1 6 4 0培养液(MP O S缓冲液) 。抗真
7、菌药 第2期.朱红梅, 等.红色毛癣菌对抗真菌药物的敏感性与种株特异性的关系1 3 7 物: 伊 曲 康 唑 ( I T R A) 、酮 康 唑 (K C Z) 、氟 康 唑 ( F C Z) 、 特比萘芬(T B F) 、 萘替芬(NT F) 、5 -氟胞嘧 啶( 5 - F C) 、 两性霉素B(Am B) , 均为药厂提供的原 粉。其他试剂: T a q D NA聚合酶、P C R反应缓冲 液、 d NT P s( 日本T a K a R a) 。 1. 3 红色毛癣菌的种内基因分型 基因组D N A制 备采用氯化苄法 1。红色毛癣菌的 P C R鉴定: 引物 (G A C A) 4,
8、反应条件:9 4 起始变性5m i n;9 4 变 性1m i n,4 7退火1m i n,7 2 延伸1m i n, 3 8个循 环; 7 2 延伸5m i n。红色毛癣菌的种内分型: 采用 基因组D N A的R A P D方法。随机引物共1 0条( P 1 - 1 0, 上海生工生物工程有限公司合成, 每条1 0个碱 基) 。P C R反应条件: 9 4 起始变性5m i n;9 4 变性 4 5s,3 6 退火1m i n,7 2 延伸2m i n,4 7个循环; 7 2 延伸7m i n。产物进行1 . 2 %琼脂糖凝胶电泳, G E N EG E N I U SB i o i m a
9、 g i n gS y s t e m成像。 1. 4 体外抗真菌药物敏感性研究 参考 N C C L S 的M 3 8 - A方案 2。 1. 4. 1 抗真菌药物稀释液的准备 将7种药物用 1 0 0%二甲基亚砜配制为浓度1 2. 8m g/m l的母液, 用R PM I1 6 4 0培养液进行1 0级倍比稀释, 使其工 作终浓度: 伊曲康唑、 酮康唑为0. 0 1 88g/m l, 特 比萘芬为0. 0 0 10. 5g/m l, 萘替芬(NT F) 、 两性 霉素B为0. 0 0 42g/m l, 氟康唑为0. 0 6 33 2 g /m l, 5 -氟胞嘧啶为0. 52 5 6g/m
10、 l。 1 . 4 . 2 菌悬液的制备 实验菌株接种于P D A培养 基, 收集孢子和菌丝( 以菌丝分隔处记为1个C F U) , 用R P M I 1 6 4 0培养液稀释至( 2 4) 1 0 4C F U /m l。 1. 4. 3 药敏板的制备 取9 6孔板, 按药物稀释液 的浓度由高到低依次加入1 0 0l药液, 第1 1孔作 阳性对照, 第1 2孔作空白对照。依次加入1 0 0l 已制备好的菌悬液( 双倍终浓度) 。 1. 4. 4 最小抑菌浓度(M I C) 的判定 3 0恒温箱 培养6d, 进行结果判定。肉眼观察法: 与阳性对照 比较,8 0%以上受抑制( 1级) 为判定终点
11、; 酶标仪 测定法: 在4 5 0n m波长下, 与阳性对照孔相比, 将 光密度值降低9 0%以上的最低药物浓度定义为 M I C终点。结果判断依据上述两种方法的结合。 1. 5 统计学处理 采用多组样本间比较的 W i l c - o x o n秩和检验。 2 结 果 2. 1 红色毛癣菌的种内基因分型 ( GA C A)4作引 物扩增下, 不同表型的所有红色毛癣菌菌株均呈现 相同的带型。以随机引物扩增不同表型的红色毛癣 菌临床分离株的基因组D NA, 呈现出不同的带型。 如, 以随机引物P 3扩增时, 在电泳凝胶上, 可观察 到红色毛癣菌菌株呈现5种不同的带型( 图1) 。 型的菌株包括R
12、 1 0、 2、1 5、2 0,型的菌株包括R 2 1、 1 2、1、9、1 2、1 3、1 6、1 8,型的菌株包括R 1 4、1 7, 型的菌株包括R 3,V型的菌株包括R 1 9、 2 4、2 5、2 7。 标准菌株为型。 图1 部分红色毛癣菌临床株基因组 D N A的R A P D( 随机引物P 3) 结果 F i g1P C Rf i n g e r p r i n t i n go f? % A # ) A ( * # . % + B % + 2 - 1 0:R 1 0,2,1 5,2 1,2 0,1 1,1,9,1 2;1 2 - 2 0: R 1 3,1 4,1 7,3,4,2
13、 5,1 9,2 4,2 7;R 1 - 2 0r e p r e s e n td i f f e r e n to r i g i n so f t h eT r i c h o p h y t o n r u b r u ms t r a i n s 我们观察到同一种D NA型可能包括不同表型 的菌株。型的菌株包括了5种表型;型的2株 菌均为粉末型;V型的4株菌均为羊毛或绒毛表型。 从表型方面来看, 羊毛或绒毛型菌株覆盖了、 、V型4种D NA型; 颗粒型的2株菌均为型; 沟纹型菌株包括、等3种D NA型; 在粉末、 沟纹、 颗粒型等3种表型的菌株均未发现D NA V 型。而不同部位分离
14、的菌株可以包括不同表型、 基 因型。 2. 2 红色毛癣菌临床分离株对7种抗真菌药物的 体外敏 感 性 以 进 行 种 内R A P D分 型 的R 1 - 3、 R 1 0、R 1 2 - 2 1、R 2 4、R 2 5、R 2 7及标准菌株等1 8株为 例。结果见表1。不同基因型、 表型及不同部位分 离的红色毛癣菌菌株对特比萘芬、 萘替芬、 伊曲康唑 的M I C值 范 围 较 集 中 ( 分 别 为0. 0 1 60. 0 3 2、 0. 0 3 20. 0 6 3、0. 2 51g/m l) , 且前两者的M I C 值更小( 众数均为0. 0 3 2g/m l) , 而对酮康唑和氟
15、康唑的M I C值范围则相差较大( 分别为0. 2 52、 13 2g/m l) 。对红色毛癣菌临床株的基因型、 表 型、 分离部位与菌株的抗真菌药物敏感性采用多组 样本间的W i l c o x o n秩和检验进行比较, 结果发现, 红色毛癣菌对特比萘芬、 萘替芬、 伊曲康唑、 两性霉 素B等4种抗真菌药物的敏感性与基因型、 表型、 分离部位的不同无显著相关。 1 3 8 第二军医大学学报 2 0 0 6年2月, 第2 7卷 表1 Y种抗真菌药物对红色毛癣菌的体外抗真菌活性(M I C Z V) T a b1 S u s c e p t i b i l i t i e so f? % A #
16、 ) A ( * # . % + B % + K C Z:K e t o c o n a z o l e; F C Z:F l u c o n a z o l e;T B F:T e r b i n a f i n e;NT F:N a f t i f i n e;5 - F C:5 - F l u c y t o s i n e;Am B:Am p h o t e r i c i nB 3 讨 论 近年来抗真菌药物的研究和发展令人瞩目, 很 多新开发的药物各自呈现出不同的抗菌谱。而另一 方面, 浅部致病真菌的种类和比例也处于一个较大 的动态变迁过程中。因此, 治疗方案要求以特定的 病原菌为目
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