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1、细粒棘球蚴感染小鼠 T 淋巴细胞亚群的变化及意义 于 飞1*,康金凤1,伊藤亮2,张 琰3 (新疆医科大学1基础医学院病原学教研室,新疆 乌鲁木齐 830054;2日本旭川医科大学寄生虫学教研室, 日本 旭川 079-8510; 3新疆维吾尔自治区包虫病临床研究所,新疆 乌鲁木齐 830054) 摘要:目的: 探讨细粒棘球蚴病宿主体内 T 淋巴细胞亚群在免疫调节和发病中的作用。方法: 对感染细粒棘 球蚴的昆明种小鼠观察 20 周, 在不同时间取脾制备细胞悬液, 用流式细胞术 (FCM) 检测 CD4 + 、 CD8 + 淋巴细胞的 百分率。结果:细粒棘球蚴感染后的小鼠, 于 2 周时 CD4
2、+ 、 CD8 + 淋巴细胞的百分率明显增高 ( P 0. 01) , 随后 CD4 + 的百分率逐渐降低, CD8 + 的百分率逐渐增高, 至感染 16 周后, CD4 + 的百分率较正常对照组下降 ( P 0. 01) , CD8 + 的百分率较正常对照组升高 ( P 0. 01) , CD4 + / CD8 + 比值降低 ( P 0. 01) 。结论:感染细粒棘球蚴的小鼠 早期以 CD4 + 细胞反应为主, 具有保护性免疫, 感染后期逐渐以 CD8 + 细胞为主, 使机体呈免疫抑制状态, 有利于细 粒棘球蚴增殖。 关键词:细粒棘球蚴; CD4 + 淋巴细胞; CD8 + 淋巴细胞; 流式
3、细胞术 中图分类号: R-332;R383. 33;R331. 144 文献标识码: A 文章编号: 1009-5551 (2005) 05-0402-03 Changes in T-cell subpopulation in kunming miceinfected with Echinococcus granulosus YU Fei,KANG Jin-feng,Iroc,et al (Department of Pathogenic Biology,Xinjiang Medical University,Urumqi 830054,China) Abstract:Objective:To
4、 explore the immunological regulation mechanism of mice infected with Echinococcus granulosus. Methods:The course of the infection was observed for 20 weeks. Spleen cells from mice infected with Echinococcus granulosus were collected in different period, CD4 + and CD8 + cell levels were determined b
5、y flow cy- tometre. Result:Two weeks after infection, the CD4 + and CD8 + cell levels showed a significant increase ( P 0. 01) ,then CD4 + cell decreased and CD8 + cell increased gradually. Since 16 weeks after infection, the percentage of CD4 + cell were higher than that of control group ( P 0. 01)
6、 and the percentage of CD8 + cell were lower than that of control group ( P 0. 01) . There was a significant drop down of CD4 + / CD8 + ratio since 16 weeks after in- fection ( P 0. 01) . Conclusion:CD4 + cell is mainly response in the early stage of infection,CD4 + response is replaced by CD8 + res
7、ponse in later period of infection. CE host exhibits an immune inhibition response, which is very useful to hosts with Echinococcus granulosus infection. Key words:Echinococcus granulosus;CD4 + cell;CD8 + cell;flow cytometry (FCM) 棘球蚴病是由棘球绦虫的中绦期寄生人体和动 物所引起, 由细粒棘球蚴所致的称为囊型棘球蚴病 (Cyst echinococcosis, CE
8、) , 由泡状棘球蚴所致的称 泡型棘球蚴病 (Alveolar echinococcosis, AE) , 它们均 是严重危害人畜健康的人兽共患寄生虫病。棘球绦 虫感染宿主后所引发的机体免疫应答较为复杂, 涉 及细胞免疫和体液免疫, 是免疫损伤和免疫保护并 存的过程 1, 2。近几年来, 许多研究均集中于棘球 绦虫感染后宿主体内的免疫应答机制。本文用流式 细胞术 (FCM) 动态观察了感染细粒棘球蚴病小鼠 的 T 淋巴细胞亚群, 以探讨细粒棘球蚴感染后不同 时间 T 淋巴细胞亚群在棘球蚴病细胞免疫调节中 204新疆医科大学学报 JOURNAL OF XINJIANG MEDICAL UNIVE
9、RSITY 2005 May, 28 (5) *作者简介: 于飞 (1978 - ) , 女, 在读研究生, 研究方向: 包虫病免疫。 的作用及意义。 1 材料与方法 1. 1 动物模型与分组 56 只雌性昆明种健康小 鼠, 体重 18 22 g (新疆医科大学动物实验中心提 供) 。细粒棘球蚴原头节由新疆乌鲁木齐市赛马场 提供, 从刚宰杀的自然感染的绵羊细粒棘球蚴中无 菌法采集含有原头节的囊液, 用无菌生理盐水反复 漂洗后伊红染色, 显微镜下可见活的原头节占 95% 以上, 用无菌生理盐水制成 104个原头节/ ml 的原 头节悬液, 以 250 IU/ ml 的浓度加入青霉素、 链霉 素。
10、随机选择 8 只健康小鼠作为对照组备用, 其余 小鼠以 9 号针头每只腹腔接种 0. 2 ml 细粒棘球蚴 原头节悬液, 感染小鼠制备成动物模型, 随机分成 6 组 (感染组) , 每组 8 只小鼠, 分别在感染后 2、 4、 8、 12、 16、 20 周备用。 1. 2 小鼠脾细胞悬液制备 处死细粒棘球蚴感染 不同时期的小鼠和正常对照组小鼠, 无菌摘取小鼠 脾脏, 置于盛有 D-Hanks 液的小皿中, 用无菌注射器 柄碾 碎 脾 脏, 经 200 目 筛 网 过 滤, 离 心 10 min (1 000 r/ min) , 用 0. 83% NH4Cl 溶液溶解红细胞, 每次 5 min
11、, 共 2 次。用 D-Hanks 液洗 2 遍, 离心 10 min (1 000 r/ min) 。脾淋巴细胞用含 10% 新生牛血 清的 RPMI1640 培养液 (CALTAG 公司) 调整细胞浓 度至 5 106/ ml。 1.3 小鼠 CD4 + 、 CD8 + 淋巴细胞的测定 取 5 106/ ml 脾淋巴细胞悬液各 100 l, 分别置入 2 个试管中, 分别加入 2 l 大鼠抗小鼠 PE-CD4、 大鼠抗小鼠 PE- CD8, 阴性对照管中加入 PE-IgG2a (CALTAG 公司) , 避光静置20 min 后加入稀释液500 l, 摇匀。设置各 通道之间的荧光补偿后,
12、FCM (Epics Altra, BECKMAN 公司) 检测 T 淋巴细胞亚群的比例。 1.4 统计学处理 应用 SPSS11. 0 软件对数据进行 统计学分析, 采用 t 检验, 检验水准 =0. 05。 2 结果 感染细粒棘球蚴的小鼠其 CD4 + 的百分率在感 染后 2 周为 (30. 612 3. 996) %, 比正常对照组显 著增高 ( P 0. 01) , 随后则有逐渐下降的趋势, 在 感染后 16 周和 20 周时分别降至 (21. 975 1. 288) %和 (21. 750 1. 889) %, 均显著低于正常对 照组 ( P 0. 01) 。CD8 + 的百分率在感
13、染后 2 周也 高于正常对照组 ( P 0. 05) , 为 (19. 587 3. 039) %, 在感染 4 周时 CD8 + 的百分率降至 (15. 013 1. 101) %, 随后又有逐渐上升的趋势, 在感染 16 周和 20 周时分别升至 (18. 475 0. 968) % 和 (20. 137 2. 192) %, 均显著高于正常对照组 ( P 0. 01) 。CD4 + / CD8 + 随着感染时间的延长逐渐下降, 至感染 16 周和 20 周时已明显低于正常对照组 ( P 0. 01) 。结果见表 1 及图 1、 2、 3。 表 1 FCM 检测细粒棘球蚴感染小鼠的 T 淋
14、巴细胞亚群 (-x s) 组别感染后周数鼠数 T 淋巴细胞亚群 (%) CD4 + CD8 + CD4 + / CD8 + 对照组825.825 2.95815. 612 1. 8161. 625 0. 128 感染组2830.612 3.996*19. 587 3. 039*1. 570 0. 10 4824.988 1.85915. 013 1. 1011. 665 0. 08 8825.112 4.18016. 300 3. 1051. 556 0. 140 12824.575 2.29216. 350 1. 6121. 502 0. 046 16821.975 1.288*18. 47
15、5 0. 968*1. 239 0. 136* 20821.750 1.889*20. 137 2. 192*1. 084 0. 044* 注: 与对照组相比,*P 0.05,*P 0.01 图 1 小鼠感染后 CD4 + 淋巴细胞的变化 图 2 小鼠感染后 CD8 + 淋巴细胞的变化 图 3 小鼠感染后 CD4 + / CD8 + 变化 3 讨论 流式细胞术 (Flow cytometry, FCM) 是利用流式 细胞仪对生物颗粒 (如细胞、 微生物等) 的多种物理 和生物学特性进行定量分析, 并可对特定细胞群体 加以分选的新的细胞参量计量技术, 已被广泛应用 于基础及临床医学研究中 3。本
16、实验采用荧光标 304新疆医科大学学报 JOURNAL OF XINJIANG MEDICAL UNIVERSITY 2005 May, 28 (5) 记技术, 使具有 CD4或 CD8表面抗原的 T 淋巴细胞 结合相应的荧光抗体, 经流式细胞仪计数 CD4 + 、 CD8 + T 淋巴细胞在有核细胞中各占的百分率, 以此 来了解宿主免疫功能的变化。该方法简便、 快速、 准 确, 减少了人为因素的偏倚。 宿主感染棘球绦虫后免疫功能的改变是复杂 的, 涉及到许多的免疫细胞和免疫分子 4。其中 T 淋巴细胞不仅是效应细胞, 而且也是免疫调节细胞, 在棘球蚴与宿主的相互关系中发挥着重要的作 用 5。
17、T 淋巴细胞按其功能可分为 CD 4 +( TH/ TDTH) 和 CD8 + (TS/ TC) 等细胞亚群。CD4 + T 细胞 具有辅助和诱导功能, CD8 + T 细胞具有抑制和细胞 毒性功能, 各功能亚群之间是相互联系、 相互促进、 相互制约的。CD4 + / CD8 + 比值的动态平衡反映了 机体免疫调控状态和免疫水平, CD4 + / CD8 + 比值降 低标志着机体免疫功能抑制 6。Bonder 等7通过 实验证实棘球蚴病的病程进展与 T 淋巴细胞亚群 的比例有关。 本实验利用 FCM 对细粒棘球蚴感染小鼠脾淋 巴细胞中 CD4 + 和 CD8 + 细胞亚群进行动态观察, 发 现
18、脾细胞在感染早期以 CD4 + 细胞为主, 随着感染 时间的延长, CD4 + 细胞逐渐减少, CD8 + 细胞逐渐增 多, 在感染 16 周时变化明显, 并且出现 CD4 + / CD8 + 比值快速下降。本实验的结果与 Rueda 等 8动态 观察到的细粒棘球蚴感染小鼠脾细胞中 CD4 + 、 CD8 + 百分率及 CD4 + / CD8 + 比值变化呈现相同的趋 势。不同的是, 本实验发现, 在感染 2 周时小鼠脾细 胞 CD4 + 、 CD8 + 百分率均显著高于正常对照组, 但 CD4 + / CD8 + 比值与正常对照组相比差异无统计学 意义, 可能是因为在感染早期, 机体的免疫系
19、统对进 入体内并不断增殖的原头节产生强烈的免疫应答。 这表明在继发性细粒棘球蚴感染小鼠的过程中, 早 期以 CD4 + 细胞为主, 形成保护性免疫, 晚期以 CD8 + 为主, 机体的细胞免疫呈抑制状态, 有利于棘 球蚴增殖。因此, 临床上在对棘球蚴病进行治疗时, 采取提高机体免疫力的措施将有利于治疗及恢复。 参考文献: 1 Gottsrein B,Mesarina B,Tanner I,et al. Speccific cellular and humoral immune responses in patients with different long-term courses of a
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