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1、组织工程心脏瓣叶皮下包埋实验 简旭华 1,张镜方1,胡 平2,沈 雁3,钟灿灿3(1 广东省心血管病研究所心外科,广东 广州510080;2北京清华大 学化学系,北京100000;3广州市创伤研究所,广东 广州510220) 摘要:目的 探讨体外生成的组织工程心脏瓣叶在体内可能存在的组织活性。 方法 裸小鼠12只,将体外培养的种植有 平滑肌/成纤维及内皮细胞的瓣叶(实验组)和未种植细胞的支架片(对照组)包埋于裸小鼠背部皮下,观察支架片局部 皮肤变化。 分12、14、21、28 d 4个时间段各处死3只小鼠,大体观察、组织学检查。 结果 包埋12、14 d,活体显示实验组 局部皮肤色泽红润,大体
2、标本呈自体组织色泽。 对照组活体局部皮肤及大体标本均苍白。HE染色结果显示,包埋12 d, 实验组细胞数量比对照组多,材料中部有肌纤维形成。 对照组细胞数少,无肌纤维形成。 至第28天,两组细胞数量均明 显增加,对照组细胞仍较少。实验组显示纤维包膜内有肌纤维形成,对照组无。VG染色结果显示,种植后第12天,实验 组有红染胶原纤维形成。 对照组无明显的阳性染色胶原纤维。 结论 组织工程心脏瓣叶在体内具有组织活性,如进行自 体瓣叶原位移植可能具备生长能力。 关键词:裸小鼠;组织工程;心脏瓣膜 中图分类号:R318 文献标识码:A 文章编号:1673-4254(2006)05-0573-03 !“#
3、$“%r=i0/.n3.3i4n,=0A?2A/.r=1iB;r8/iC;=3i?A;= 14r0.3i4n=24A/d=B;=?;n=(.rr4:7D 图2=包埋12=d,细胞较图2明显少,而且材料中部 细胞稀少,周围有包膜形成,对照组HE染色 (Origin./=0.gni1i2.3i4n5=67 Eig.2 HE Staining of non8seeded s affolds 9:;/?=.13;r=i0/.n3.3i4n,=4n/=.=1;:=2;/?=:;r;= ?;n=4n=3F;=?2.114/d?D 图G=包埋2H=d,大量细胞生长于周边,中部细胞略少, 有支架材料残留,包膜
4、内有多量肌纤维形成(箭头)% 实 验组HE染色(Origin./=0.gni1i2.3i4n5=67 Fig.3 HE Staining of ell8seeded s affolds 9:;n38;igF3=d.?=.13;r=i0/.n3.3i4n,=;I3;n?i;=0A?2A/.r=1iB;r= 14r0.3i4n=(.rr4:7=:.?=4B?;r;d=And;r=3F;=?2.114/d=2.?A/;?D 1D2D2组织工程心脏瓣叶体外细胞种植收集细胞,将 收集的细胞在瓣叶支架的正反面,JKEK培养,连续 6=d。先种植成纤维、平滑肌细胞,后种植内皮细胞。以 首次种植成纤维、平滑肌
5、细胞时间计算, 培养2H=d后 裸鼠皮下种植。 1D2DG组织工程心脏瓣叶的包埋(1)将培养2H=d的 瓣叶片,修剪为面积约LDM=202大小,将JKEK浸泡 后的空白组支架材料作相同处理。 (2)在NOPNQR裸小 鼠一侧胁背部使用碘伏消毒,使用消毒眼科剪于消毒 部位皮肤剪开一长度LDS 20的切口。 (G)钝性分离皮 下组织,分离时保持浅表不要进入肌肉层。(6)将实验 组瓣叶片(有细胞)包埋入裸鼠皮下。 (S)在裸小鼠对侧 同一部位使用同样方法包埋对照组支架片(无细胞)。 分别在12、16、21、2H d 6个时间段各处死G只小 鼠,取出组织片大体观察并部分送组织学检查。 1D2D6观察、
6、 检测项目 观察包埋部位皮肤是否感染、 坏死及局部皮肤色泽是否红润。 处死小鼠,取出包埋 片观察各时间段支架片的色泽性状。瓣膜组织片取出 后立即使用中性福尔马林固定, 送病理检查行HE、 TU检查,观察瓣膜片细胞生长情况、细胞量。 2 结果 2D1大体观察 2D1D1 活体观察裸小鼠生存良好,无明显炎症水肿, 切口愈合良好,无感染、坏死。 包埋12V16 d,实验组 裸小鼠局部皮肤色泽红润, 而对照组局部明显苍白, 差别显著。21、2H d两组裸小鼠局部皮肤均色泽红润, 肉眼观察差别不大。2H d时,局部可见支架形态,可触 及质地较硬的支架材料。 2D1D2 标本观察12、16 d实验组支架片
7、呈现裸小鼠组 织色泽,而对照组支架片色泽较为苍白。G、6周两组 间肉眼无差别, 包埋片均呈现机体组织相同色泽,触 摸材料质地较硬,尚未完全降解。 2D2组织学结果 2D2D1 HE染色包埋12 d,实验组切片中部细胞与周 边细胞均较多, 材料中有肌纤维及血管腔形成 (图 1)。 对照组细胞主要集中于材料的周边,少数细胞向 中部侵入生长,无肌纤维及小血管生成(图2)。种植6 周的材料, 低倍镜下见两组细胞数量均明显增加,但 细胞生长、细胞种类仍存在差别,实验组切片可见细 胞于材料中部及周边生长均好,周边细胞较多,纤维 包膜内及材料上已有多量肌纤维形成。对照组切片中 部细胞量仍相对较少,未见肌肉纤
8、维的生成。另外,两 组切片均有炎症反应,至G、6周炎症明显消退。 各期 均未出现组织坏死。 包埋2H d仍可见大量支架材料 残留(图G)。 2D2D2 TU染色包埋12 d,实验组切片有红染胶原纤 维,而对照组支架无明显阳性染色的胶原纤维。 包埋 16 d后,两组均有一定量胶原生成,切片观察无明显 差异。 G 讨论 南方医科大学学报WX Y4A3F K;d Zni7 第2卷 S6 S6 过去的五十年,因瓣膜研究的进展,众多心脏瓣 膜病患者的生活质量、生存时间得到明显提高。 但人 工心脏瓣膜存在感染、衰坏、血栓栓塞等缺点,目前研 究显示,人工瓣膜的这些缺点有望使用组织工程瓣膜 解决1,2。 组织
9、工程是组织培养技术与生物工程学相结合 产生的学科。理论上,其产物具有自体组织活性、完整 的生理功能及良好的组织相容性,从而使患者受损的 体内组织或器官功能得到最佳修复、维持或改善3,4。 1996年Shinoka5首先报道使用高分子可降解聚 合物PGA制成片状瓣叶, 将体外培养扩增的羊自体 动脉成纤维、 平滑肌细胞及内皮细胞种植于瓣膜片 上,经体外培养1周后将瓣叶用于置换羊(细胞来源) 肺动脉瓣叶, 结果显示,6周以后瓣叶具有自体瓣膜 特征。这一实验结果促进了组织工程心脏瓣膜的研究 进程。国内对于组织工程心脏瓣膜的研究尚无体内研 究报道。 汪钢6报道使用皮下包埋实验,研究未种植 细胞的胶原膜和
10、PHB的组织相容性, 结果显示支架 周围局部存在组织炎症反应,无脓肿、坏死改变,认为 材料组织相容性良好。 相关研究显示79研究显示将 种植种子细胞的材料支架种植到裸鼠体内,在无免疫 排斥状态下,种植于支架载体上的种子细胞可沿支架 生长,用于检测细胞/材料复合物活性。Mizuno H8 将羊椎间盘纤维环细胞和髓核细胞体外分离扩增后, 复合种植在聚乙醇酸上,植入裸鼠背部皮下,12周后 取出行大体及组织学检测,显示植入的细胞/支架复 合物具有活性,可生成椎间盘组织。 本实验使用34周裸小鼠,将支架片移植于裸小 鼠背部靠近头皮下,有3个优点:(1) 易于观察组织 片的活性。(2)由于该部位血管丰富,
11、为带细胞材料成 活提供了条件。(3) 该部位不影响裸小鼠的活动。(4) 可通过平滑肌组织的增生而排除皮下纤维结缔组织 长入支架材料产生的组织增生假相。通过大体标本的 观察、包埋部位皮肤色泽及组织学检测等方法,评估 支架片种植细胞后,细胞是否存在活性,能否继续分 裂增殖。 结果显示包埋12、14 d后,实验组活体观察, 皮下瓣叶支架材料色泽红润,细胞明显较多。 至28 d 时, 镜下检查材料纤维包膜内可见多量的肌纤维形 成,显示细胞增值良好,经体外种植的平滑肌细胞在 包裹材料包膜内已生成肌肉纤维组织,提示种植平滑 肌/成纤维细胞的瓣叶,平滑肌细胞在裸鼠皮下具有 生物学活性,能生长成为相应组织,而
12、对照组虽有纤 维生长,却无肌性组织形成。另外,早期实验组切片显 示有胶原蛋白存在, 表明瓣叶已具有基质合成能力, 即具有生物活性。以上结果显示组织工程心脏瓣叶存 在生长活性,如将其进行原位移植,在血流动力生长 环境下,可能生成具有活性的心脏瓣叶。 参考文献: 1Oxenham H, Bloomfield P, Wheatley DJ, et al. Twenty year comparison of a Bjork_Shiley mechanical heart valve with porcine bioprosthesesJ. Heart,2003, 89: 715_21. 2Moffat
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