细胞间直接接触对骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞作用的研究.pdf
《细胞间直接接触对骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞作用的研究.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《细胞间直接接触对骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞作用的研究.pdf(4页珍藏版)》请在三一文库上搜索。
1、细胞间直接接触对骨髓间充质干细胞 分化为心肌细胞作用的研究 于玲范*,金丹玲,周晶 (哈尔滨医科大学第二临床医学院 心外 ICU,黑龙江 哈尔滨 150081) 摘要 目的探讨体外心肌细胞 (cardiomyocytes, CM) 与骨髓间充质干细胞 (bone marrow stromal cells, MSCs) 共培养 时, 骨髓间充质干细胞与心肌细胞间直接接触对其分化为心肌细胞的影响。方法API (4, 6-二咪基-2-苯吲哚盐酸) 标记后, 分别与心肌细胞按接触组和非接触 (millicellTM-HA 半透膜) 组培养, 1 周后应用免疫荧光检测 MSCs 肌钙蛋 白 T (cTn
2、T) 的表达, 并用 RT-PCR 方法检测 NKx-2.5、 GATA-4、 TGF-的表达。结果接触培养组中可见 DAPI 标记的 骨髓间充质干细胞表达 cTnT, NKx-2.5、 GATA-4、 TGF-有高表达, 非接触组的 MSCs 未见 cTnT 的表达, 相关基因仅有 低表达。结论心肌细胞与 MSCs 的直接接触, 是诱导 MSCs 分化为心肌细胞的重要因素。 关键词 骨髓间充质干细胞; 心肌细胞; 直接接触; 基因 中图分类号R - 332; R392.21文献标识码A 文章编号1000 - 1905 (2006) 02 - 0124 - 04 Study of the ef
3、fect of cell-cell direct contact to the bone marrow stromal cells differentiate into cardiomyocytes YU Ling-fan, JIN Dan-ling, ZHOU Jing (Department of Cardiac Surgery ICU, The Second Clinical College, Harbin Medical University, Harbin 150081, China) Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of ce
4、ll-cell direct contact to the bone marrow stromall cells (MSCs)differentiate into cardiomyocytes (CM)when MSCs co-cultured with cardiomyocytes in vitro .Methods The 5-6th generation of MSCs was isolated and purified, after labeled by DAPI, cultured with cardiomyocytes through direct and indirect(mil
5、licellTM-HA semipermeable membrane ) contact. One week later, cell immun- ofluorescence was carried to detect the expression of cTnT of MSCs, using RT-PCR to investigate the expression of NKx-2.5, GATA-4, TGF-.ResultsThere was high expression of NKx-2.5, GATA-4, TGF-of the MSCs in direct contact gro
6、up, cTnT is positive, and there was low expression of NKx-2.5, GATA-4, TGF-in indirect contact group, and cTnT expression was negative.ConclusionIt demonstrates that the direct contact of MSCs and cardiomyocyte is essential for MSCs differentiation into cardiomyocytes. Key words:marrow stromal cell;
7、 cardiomyocytes; direct contaction; gene 收稿日期2005 - 11 - 18 作者简介于玲范 (1961 - ) , 女, 黑龙江青冈人, 主任医师, 硕士研 究生导师。*通讯作者 MSCs 具有多向分化潜能, 在一定条件下可以分 化为软骨细胞、 成骨细胞、 脂肪细胞、 神经细胞和心 肌细胞等。虽然多种体内实验表明成体干细胞可以 促进缺血性心脏病心功能的改善, 但是有关间充质 干细胞向心肌细胞分化的机制尚不清楚。本文采用 体外培养的心肌细胞模拟心肌样环境, 与 MSCs 共 培养, 相对于体内细胞移植具有较好的直观性和可 靠性, 并从基因水平研究 MS
8、Cs 的分化, 为干细胞的 临床应用提供理论基础。 1材料与方法 1.1材料 成年 SD 大鼠雄性 (100 120g) ; 新生 3 天同种 系大鼠 (哈尔滨医科大学动物中心供) ; DMEM 高糖 培养基 (Hyclone) ; 优质胎牛血清 (杭州四季清) ; Per- coll s 细胞分离液 (Pharmacia 司) ; DAPI (4, 6-二咪基- 421 第 40 卷第 2 期 2006 年 4 月 哈尔滨医科大学学报 JOURNAL OF HARBIN MEDICAL UNIVERSITY Vol.40, No.2 Apr., 2006 2-苯吲哚盐酸)(美国 Roche
9、公司) ; 心肌肌钙蛋白 T (美国 DAKO 公司); TRITC 连接的山羊抗大鼠!gG (Oxford B iotechnology 公司 ) ; 0.1%!型胶原酶 (Sig- ma) ; Trizol (Invitrogen) ; 逆 转 录 试 剂 盒 (Invitrogen) ; dNTPs Taq DNA 聚合酶 250bp DNA Ladder (北京博大 泰克公司) ; PCR 扩增仪 (Heraeus 公司) ; CO2恒温培 养箱 (Heraeus 公司) ; 倒置相差显微镜 (olympus) ; 荧 光显微镜 (olympus) 。 1.2方法 1.2.1大鼠 MS
10、Cs 的分离与培养: 无菌条件下采集 成年 SD 大鼠双侧股骨、 胫骨, 用 DMEM 培养液冲洗 骨髓腔, 200 目不锈钢滤网过滤骨髓液, 用 Percoll s 液 (密 度 1. 073g/ml) 梯 度 离 心(2 400r/min 离 心 20min) 后分离单个核细胞, PBS 洗涤 2 次 (1 200r/min 离心 10min) , 然后加入含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养液中, 以 5 105个/ml 接种于培养瓶, 置 37的 5% CO2培养箱中孵育。24h 后更换培养基, 以后每 3 4d 换液 1 次。待细胞亚融合或接近融合 (12 14d) 时传代。 1.
11、2.2心肌细胞的分离和培养: 于无菌操作下, 将 乳鼠的心室肌剪成 1mm3大小的碎块, 用 DMEM 洗 1 次。弃去带血的上清液, 组织碎块中加入 0. 1% 胶 原酶消化, 每次 37 12min, 首次消化液弃去, 细胞 悬液转移到含有 20ml DMEM 培养液的无菌试管中, 并以 1 000r/min 离心 5min, 弃上清液, 细胞沉淀再次 用培养液重悬。细胞悬液置于平皿中 37 静置。 90min 后, 小心吸出细胞悬液, 接种到另一培养皿 中, 密度为 1 104个/f, 2, 3d 后用于实验。 1.2.3MSCs 的标记: 将第 5-6 代的 MSCs 用 4, 6-二
12、 脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) (1 “g/ml) 标记 2h, 并用 D- hank s 液漂洗 10 次后, 在荧光显微镜下用紫外光激 发 (激发波长 340 380nm) , 观察标记效果。 1.2.4不同培养体系培养: 消化 DAPI 标记的 MSCs 细胞, 接触组以 104/ml 的密度加入长有心肌细胞的 培养板内, 非接触组先在心肌细胞培养体系内放入 millcellTM-HA 装置 (孔径 0. 45“m) , 此装置使 MSCs 和心肌细胞不能直接接触, 但心肌细胞分泌的一些 细胞因子和活性成分可以通过。MSCs 以相同密度 加入此体系中培养。 1.2.5免疫荧光检测:
13、培养 1 周后将长有细胞的玻 片取出, 用 4%的多聚甲醛固定 10min。磷酸盐缓冲 液 (PBS)洗 3 次后, 分别加入以 1:10 和 1:100 稀释 的抗心肌特异性肌钙蛋白 T (cTn T) 抗体于 4孵育 2h。再用罗丹明标记的山羊抗小鼠 IgG (IgG/TRITC ) 孵育 1h。DAPI 的激发光波长为 358nm, 荧光激发下 发蓝光, TRITC 的激发光波长为 550nm, 荧光激发下 发红光, 两者的激发光谱并不重合。通过在同一视 野下转换激发光, 查找有 Troponin T 表达的 DAPI- MSCs , 可见少数蓝色细胞核周围的胞浆发出红色荧 光。 1.2
14、.6RT-PCR 检测 NKx-2.5、 GATA-4、 TGF-#mRNA 的表达: 采用 Trizol 试剂提取总 RNA 测定 OD 值计 算总 RNA 纯度, 按 RT-PCR 试剂盒进行逆转录制备 cDNA, PCR 反 应 体 系 为 10 buffer 2. 5“l, 25mmol Mg2 +2.0“l, 10mmol dNTP 0.5“l, 上游引物 1.0“l, 下 游引物 1.0“l, cDNA 2.0“l, 5U/“l Taq 酶 0.5“ l, 去离 子水 15.5“l。反应参数为预变性 94 4min, 变性 94 40s, 退火 60 62 40s, 延伸 72 6
15、0s。35 个循环, 进行目的基因的扩增。取 3“l 扩增产物进 行 2%琼脂糖凝胶电泳, 并采用凝胶图像分析系统 分析结果, 以#-actin 作为内对照, 将各基因净条带 的面积 强度与同时电泳的#-actin 净条带的面积 强度对比进行相对量分析。进行 3 次独立实验取 其平均值。 附表RT-PCR 引物序列 基因上游引物下游引物 NKx-2.55-CAGTGGAGCTGGACAAAGCC-35-TAGCGACGGTTCTGGAACCA-3 GATA-45-CTGTCATCTCACTATGGGCA-35-CCAAGTCCGAGCAGGAATTT-3 TGF-#5-GCCCTGGATACC
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 细胞 直接 接触 骨髓 间充质 干细胞 化为 心肌 作用 研究
链接地址:https://www.31doc.com/p-3723541.html