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1、 细胞凋亡相关新基因 Apr-3 转录剪接体的克隆、 测序 及亚细胞定位 张 静, 王文亮, 晏 伟, 郭双平, 张志培, 李擒龙, 王 丽, 严晓昱 摘要: 目的 克隆 Apr-3 基因的一个转录剪接体, 并对其进行测序及亚细胞定位。方法 培养 HL-60 细胞, 提取 HL-60 细胞总 RNA, 应用 RT-PCR 获取 Apr-3 的转录剪接体的编码区 cDNA 序列, 将该 cDNA 与质粒 pcDNA3. 1/ myc-His ( - ) B 连接, 构建克 隆载体, 将其转化 E. coli DH5, 进行测序, 与 GenBank 中登录序列比对结果正确后将该 cDNA 与质粒
2、 pEGFP-C3 连接, 并将其 转染 COS-7 细胞。结果 对测序结果进行序列分析,与 GenBank 中登录的 Apr-3 编码区完全一致。pEGFP -Apr-3 基因表达 产物定位于 COS-7 细胞的细胞膜和细胞质。结论 对 Apr-3 基因的一个转录剪接体进行克隆, 构建了真核表达载体, 首次发 现 Apr-3 的该转录剪接体主要在真核细胞的细胞膜和细胞质表达, 为后期对该基因的结构和功能的研究奠定基础。 关键词: Apr-3; 细胞凋亡; 转录剪接体; 克隆; 亚细胞定位 中图分类号: R 394. 2 文献标识码: A 文章编号: 1001 -7399 (2006) 03
3、-0344 -04 Cloning, sequencing and subcellular localization of a transcript variant of a noval apoptosis - related gene Apr-3 ZHANG Jing,WANG Wen-liang,YAN Wei,GUO Shuang-ping, ZHANG Zhi-pei,LI Qin-long,WANG Li, YAN Xiao-yu (Department of Pathology,Xijing Hospital,the Fourth Military Medical Universi
4、ty,Xi an 710032,China) Abstract: Purpose To clone a transcript variant of the apoptosis-related gene Apr-3 and to ascertain the subcellar localization of Apr- 3. Methods Total RNA was isolated from the cells of HL-60. The cDNA encoding the transcript variant of Apr-3 was amplified by re- verse trans
5、cription-PCR(RT-PCR) . PCR products were cloned into pcDNA3. 1/ myc-His ( - ) B vector and sequenced. Subcellar lo- calization of the transcript variant of Apr-3 was performed. Results The transcript variant of Apr-3 cDNA fragment of 690 bp was ob- tained. It was cloned into pcDNA3. 1/ myc-His ( - )
6、 B vector and the sequence was confirmed. Gene products of the transcript variant of Apr-3 were located in the cell membrane and cytoplasm of COS-7 cells. Conclusions The transcript variant of Apr-3 expresses in the cell membrane and cytoplasm of eucaryotic cells. Key words: Apr-3;apoptosis;transcri
7、pt variant;clone;subcellar localization 收稿日期: 2005 -08 -10 修回日期: 2005 -10 -14 作者单位: 第四军医大学西京医院病理科, 西安 710032 作者简介: 张 静 (1978 - ) , 女, 硕士研究生。Tel: (029) 83374541 84775497-8307 王文亮 (1934 - ) , 男, 教授, 博士生导师。Tel: (029) 83374595, E-mail:wlwang fmmu. edu. cn Apr-3 是朱峰等 1通过建立 HL-60 细胞凋亡模 型, 运用基于聚合酶链反应的改良消减杂
8、交法 (im- proved PCR-based subtractive hybirdization, ISH) 克隆 出的1 个人类新基因, 并在 GenBank 中登录, 该基因 可能参与细胞的凋亡, 但其性质、 结构、 功能尚不清 楚。目前, 该基因在 GenBank 中有2 个转录剪接体。 转录剪接体在细胞凋亡过程中有着重要的作用: 一 方面, 对调控凋亡相关基因产物的亚细胞定位有影 响, 另一方面, 对调控凋亡相关基因的功能与活性也 有影响。因此, 我们克隆了其中编码氨基酸序列中 最长的1 个, 对其进行了序列分析, 并观察其转染 COS-7 细胞的亚细胞定位, 为进一步研究 Apr
9、-3 的 结构与功能奠定了基础。 1 材料与方法 1. 1 材料 HL-60 细胞系、 大肠杆菌、 BL21、 COS-7 细胞由本实验室保存;RNA 提取试剂 Trizol 购自美 国 Gibco 公司; Pfu DNA 聚合酶购自 Promega 公司; EcoR 、 Xho 、 T4 DNA 连接酶购自 TaKaRa Bio- tech 公司; M-MLV 反转录酶、 脂质体 Lipofectamine 2000 购自 Invitrogen 公司;pcDNA3. 1/ myc-His ( - ) B 购自 Invitrogen 公司;质粒 pEGFP-C3 由本实验室 保存。 1. 2
10、实验方法 1.2. 1 设计合成引物 以 GenBank 中登录的人 Apr-3 的一个转录剪接体 (AY358968) 编码区序列为 模板设计引物: 5端引物 (Xho 位点) ATCTC- GAGATGGCGCCTCACG; 3端引物 (EcoR I 位点) 443临床与实验病理学杂志 J Clin Exp Pathol 2006 Jun; 22 (3) GCGAATTCTCATGAA GTCTTGGC。引物由上海博 亚公司合成。 1.2. 2 RT-PCR 按照 Trizol 操作指南, 提取 HL-60 细胞总 RNA, 并以此为模板进行反转录, 取上述引 物进行 PCR 扩增, 反应
11、参数95 预变性90 s, 94 30 s; 55 30 s; 72 90 s 共 30 个循环, 72 延伸 7 min, 4 保存。取反应产物 8 l 用琼脂糖凝胶电 泳鉴定。 1. 2. 3 构建克隆载体 将 PCR 产物胶回收, 用 Xho , EcoR 对目的片断, pcDNA3. 1/ myc-His ( - ) B 进行双酶切后连接, 然后将连接产物转化 E. coli DH5, 用氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆。提取 质粒进行 Xho , EcoR 双酶切, 用琼脂糖凝胶电 泳鉴定。测序进行序列分析。 1.2. 4 构建 pEGFP-C3-Apr-3 重组绿色荧光蛋白真 核表达载体
12、 用 Xho , EcoR 分别对 pcD- NA3. 1/ myc-His ( - ) B-Apr-3 与 pEGFP-C3 进行双 酶切后连接, 然后将连接产物转化 E. coli DH5, 用 卡那霉素抗性筛选阳性克隆。提取质粒进行 Xho , EcoR 双酶切, 用琼脂糖凝胶电泳鉴定。 1. 2. 5 重组绿色荧光蛋白真核表达载体转染 COS- 7 细胞及亚细胞定位检测 参照文献 2 将处于对 数生长期的 COS-7 细胞用胰酶消化,分别接种于放 置有盖玻片的 6 孔培养板中继续培养 24 48 h,使 贴壁细胞占据 90%底面积。吸出培养液, 用无血清 DMEM 培养液洗 2 遍。将
13、 3 g pEGFP-C3-Apr-3 和 3 g 空载体 pEGFP-C3 (对照) DNA 分别溶于100 l 无血 清 DMEM 培 养 液( A 液) 。将 6 l Lipo- fectamine 2000 溶于 100 l 无血清 DMEM 的培养液 (B 液) 。将 A、 B 2 液混合,轻轻摇动,室温孵育 30 min,形成 DNA-liposome 复合物。在复合物中加入 800 l 无血清 DMEM,轻轻混匀并滴加至洗过的细 胞中, 37 、 5% CO2条件下培养 8 h。吸出上述培 养液, 加入 1 ml 10% 小牛血清 DMEM 培养液继续 培养48h。PBS 洗细胞
14、3 次, 用4%多聚甲醛固定30 min, 再次用 PBS 洗后, 甘油封固。荧光显微镜蓝色 激发光下观察绿色荧光蛋白表达的部位。 2 结果 2. 1 RT-PCR 获取 Apr-3 转录剪接体 (AY358- 968) 编码区 cDNA 用 RT-PCR 扩增出编码序列 后, 用琼脂糖凝胶电泳鉴定, 可见一与目的 DNA 长 度相仿的条带 (图 1) 。 2. 2 酶切鉴定克隆载体 用 Xho 和 EcoR 对 pcDNA3. 1/ myc-His ( - ) B 与 Apr-3 编码区 cDNA 连 接产物进行双酶切后, 经琼脂糖凝胶电泳鉴定, 可见 一长约 690bp 的条带。表明得到了
15、克隆载体 pcD- NA3. 1- Apr-3 (图 2) 。对其进行序列分析与 Gen- Bank 中登录的序列一致。 图 1 Apr-3 cDNA PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳 M:DL-2000 DNA marker;1:PCR product of transcript variant of Apr- 3; 2:-actin (621 bp) 图 2 重组克隆载体 pcDNA3. 1/ myc-His ( - ) B -Apr-3 的酶切鉴定 M:DL-2000DNA marker;1:pcDNA3. 1 / myc-His ( - ) B -Apr-3 cut with Xho an
16、d EcoR 2.3 酶切鉴定重组绿色荧光蛋白真核表达载体 用 Xho 和 EcoR 对 pEGFP-C3 与 Apr-3 编码区 cDNA 连接产物进行双酶切后, 经琼脂糖凝胶电泳 鉴定, 可见一长约 690 bp 的条带。表明得到了绿色 荧光蛋白真核表达载体 pEGFP-C3- Apr-3 (图 3) 。 2. 4 pEGFP-C3-Apr-3 重组体的转染及亚细胞定 位检测 (图 4) 。 3 讨论 1972 年 Kerr 等 3首次提出细胞凋亡的概念。 近年来, 细胞凋亡已成为生物学领域的研究热点之 543临床与实验病理学杂志 J Clin Exp Pathol 2006 Jun; 2
17、2 (3) 图3 重组绿色荧光蛋白真核表达载体 pEGFP-C3-Apr-3 的酶切鉴定 M:DL-2000DNA marker; 1:pEGFP-C3-Apr-3 cut with Xhoand EcoR 图 4 pEGFP-C3-Apr-3 在 COS-7 细胞中的亚细胞定位 A:pEGFP-C3 expresses in the nuclei and cytoplasm of COS-7 cells; B:pEGFP-C3-Apr-3 expresses in the cell membrane and cytoplasm of COS-7 cells 一。细胞凋亡是一个受遗传调控的自身
18、编码死亡方 式, 涉及许多基因的共同作用 4。在过去的基因和 生物学研究中已发现许多基因与细胞凋亡有关 5。 朱峰等 1运用基于 PCR 的改良消减杂交法从经全 反式维甲酸诱导的 HL-60 细胞凋亡模型中克隆出 了一系列细胞凋亡相关基因, 其中 5 个经测序并命 名为 Apr-1 至 Apr-5。而且 Apr-1、 Apr-3、 Apr-5 经反 向杂交检测后被认为与细胞凋亡相关。Apr-3 还可 能与血细胞的发生和分化有关, 且发现该基因有 2 个转录剪接体。转录剪接体 1 是一个长转录体, 编 码异构体 a。而转录剪接体2 在5UTR 有另一个剪 接位点, 因此, 其开放编码读框向 5端
19、延伸至另一 个起始密码子, 所以异构体 b 比异构体 a 的 N 端 长 6。转录剪接体 2 位于 2 号染色体的短臂 23 区 3 带, 其基因编码区长 690 bp, 编码 229 个氨基酸。 我们根据 GenBank 中登录的 Apr-3 的转录剪接体 2 的序列 (AY358968) 设计引物, 对其基因编码区进行 克隆, 经测序其与 GenBank 中登录的 Apr-3 的 2 号 转录剪接体序列完全一致。然后将其与 pEGFP-C3 连接构建重组绿色荧光蛋白真核表达载体, 经双酶 切鉴定后将其转染 COS-7 细胞, 首次发现 Apr-3 的 该转录剪接体主要在真核细胞的细胞膜和细
20、胞质表 达。 Apr-3 的该转录剪接体定位于细胞膜和细胞 质, 而已知的死亡受体位于细胞表面, 当死亡配体与 其结合可激活死亡蛋白酶系统诱导细胞凋亡。如肿 瘤坏死因子受体基因家族, CD95 和 DR 系列。死亡 受体分为细胞膜外和胞质两区域, 前者传导死亡信 号, 后者称为死亡区域, 参与激发蛋白酶系列和细胞 产生凋亡调节机制 7。经比对 Apr-3 与凋亡相关基 因 Notch4 有 45% 的同源性 1。Notch4 基因是跨膜 受体 Notch 家族成员之一, Notch 基因在细胞分化、 发育中起着重要的作用。激活的 Notch4 基因可以 抑制汇集于线粒体的细胞凋亡途径 8。Ap
21、r-3 的该 转录剪接体可能有着类似于 Notch4 基因的作用。 这将为后期对该基因的结构和功能的研究奠定基 础。 参考文献: 1 Zhu F,Yan W,Zhao Z L, et al. Improved PCR-based subtractive hybridization strategy for cloning differentially expressed genes J . Biotechniques, 2000, 29(2): 310 -313. 2 晏 伟, 王文亮, 朱 峰, 等. 肿瘤特异性抗原超家族成员 apr- 1 基因的克隆及亚细胞定位 J . 癌症,2005,2
22、4(2): 129 - 134. 3 Kerr J F R, Wyllie A H, Currie A R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide rangeing implication in tissue kinetics J . Br J Cancer, 1972, 26: 239 -257. 643临床与实验病理学杂志 J Clin Exp Pathol 2006 Jun; 22 (3) 柠檬酸盐和 EDTA 缓冲液对弥漫性大 B 细胞淋巴瘤 Ki-67 和 bcl-2 抗原修复的比较 李 丹, 李甘地 , 刘卫平, 李俸
23、媛, 潘 云 摘要: 目的 探讨柠檬酸盐和 EDTA 缓冲液对弥漫性大 B 细胞淋巴瘤 (diffuse large B-cell lymphomas, DLBCL) 中 Ki-67 和 bcl-2 抗原修复的比较。方法 运用高压锅热抗原修复法, 选择柠檬酸盐和 EDTA 两种缓冲液同时进行抗原修复, 比较了 78 例弥漫 性大 B 细胞淋巴瘤 Ki-67 和 43 例 DLBCL bcl-2 的免疫组化染色应用效果。结果 免疫组化染色采用 EDTA 与柠檬酸盐缓冲 液相比, Ki-67 指数 78 例中有 76 例明显提高, 两者差异有统计学意义 (P 0. 01) ; bcl-2 染色 4
24、3 例中有 13 例表达明显提高, 两 者差异有统计学意义 (P 0. 01) 。结论 在实际免疫组化染色中, EDTA 缓冲液较柠檬酸盐缓冲液能极大地提高弥漫性大 B 细胞淋巴瘤的 Ki-67 和 bcl-2 抗原的表达。 关键词: 淋巴瘤, 大 B 细胞; 抗原修复; 免疫组织化学; 缓冲液; Ki-67; bcl-2 中图分类号: R 446. 6; R 733. 4 文献标识码: A 文章编号: 1001 -7399 (2006) 03 -0347 -03 Comparison of citrate with EDTA buffer in antigen retrieval of Ki
25、-67 and bcl-2 LI Dan,LI Gan-di,LIU Wei-ping,LI Feng-yuan,PAN Yun (Department of Pathology,Sichuan University Huaxi Hospital,Chengdu 610041, China) Abstract:Purpose To compare citrate with EDTA buffers in antigen retrieval for Ki-67 and bcl-2 staining in diffuse large B-cell lym- phomas(DLBCLs) . Met
26、hods Using pressure cooker heat-induced antigen retrieval, citrated and EDTA buffers were compared in Ki- 67 immunostaining in 78 cases and bcl-2 in 43 cases of DLBCL synchronously. Results The Ki-67 index was enhanced in 76 of 78 cases,when EDTA buffer was compared with citrate buffer. The differen
27、ce was statistically significant(P 0. 01) . The expression of bcl-2 protein was enhanced in 13 of 43 cases,and the difference was also statistically significant(P 0. 01) . Conclusions In clini- cal practice,the use of EDTA buffer could enhance the immunohistochemical staining of Ki-67 and bcl-2 prot
28、ein in DLBCLs signifi- cantly,compared with citrate buffer. Key words: lymphoma, large B-cell; antigen retrieval;immunohistochemistry;buffer;Ki-67;bcl-2 免疫组织化学 (immunohistochemical,IHC) 染 色是病理研究和临床病理外检诊断中常用的方法。 由于福尔马林固定时使标本的氨基酸残基分子之间 收稿日期: 2004 -09 -13 修回日期: 2005 -06 -26 基金项目: 美国中华医学基金会 (CMB) 基金资助项目
29、 (00 -722) 作者单位: 四川大学华西医院病理科, 成都 610041 作者简介: 李 丹 (1969 - ) , 男, 硕士, 现在重庆医科大学基础医学 院病理学教研室 李甘地 (1949 - ) , 男, 通讯作者。E-mail:gandi mail. sc. cninfo. net 或分子之内形成醛键, 抗原决定族被掩盖或破坏, 使 部分抗原 - 抗体反应不能顺利进行。因此, 充分的 抗原修复是 IHC 染色效果好坏的重要环节, 特别是 抗原修复处理方法和抗原修复液选择。有研究报 道, 高 pH 值 EDTA (乙二胺四乙酸) 缓冲液较柠檬 酸盐缓冲液更能提高抗体的 IHC 染色
30、效果 1。我 们在研究陈旧性石蜡块组织弥漫性大 B 细胞淋巴 瘤 (diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL) 的 Ki-67 和bcl-2蛋白表达时, 选择上述两种抗原修复液, 同 4 晏 伟, 李 青, 朱 峰, 等. 改良消减杂交法克隆人乳腺癌 MCF-7 细胞凋亡相关基因 J . 中华肿瘤杂志,2001,23(3) : 193 -195. 5 Eric N, Shiozaki, Yigong S H. Caspases, IAPs and Smac/ DIAB- LO: mechanisms from structural biology J . Tren
31、ds Biochem Sci, 2004, 29 (9): 486 -494. 6 Clark H F, Gurny A L,Abaya E,et al. The secreted protein dis- covery initiative(SPDI) ,a large-scale effort to identify novel hu- man secreted and transmembrane proteins:A bioinformatics as- sessment J . Genome Res, 2003, 13 (10) : 2265 -2270. 7 Raff M. Cell suicide for beginners J . Nature,1998,396:119 -122. 8 MacKenzie F,Duriez P,Wong F,et al. Notch4 inhibits endothe- lial apoptosis via RBP-J kappa-dependent and -independent path- ways J . J Biol Chem, 2004, 279(12): 11657 -11663. 743临床与实验病理学杂志 J Clin Exp Pathol 2006 Jun; 22 (3)
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