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1、中国应用生理学杂志, 2 0 0 6 ; 2 2 ( 2 ) 细胞间粘附分子一 1 在血管内皮细胞冻融损伤中的作用 刘嘉流, 单秋玲, 杨增仁, 颜培华, 孙方人 ( 军事医学科学院卫生学环境医学研究所, 天津 3 0 0 0 5 0 ) 摘要目的: 探讨血管内皮细胞( V E C ) 表面细胞间拈附分子一 1 ( I C A M- 1 ) 在 V E C冻融损伤中的作用, 以阐明冻融 损伤的发病机制。方法: 以大鼠主动脉V E C和大鼠外周血嗜中性粒细胞( P MN ) 为材料, 使用WK L - V型速率冷冻 仪冷冻 V E C然后在水浴中复温, 制备 V E C冻融模型。采用免疫组化法测
2、定 V E C冻融后 4 , 1 2和 2 4 h其表面 I C A M - 1 的表达; 将冻融V E C与正常P M N共同孵育后, 以r o s e b e n g a l 染色法测定冻融V E C与P M N粘附, 测定培 养液中L D L活性确定V E C损伤程度。结果:冻融后 4 h , V E C表面 I C A M- 1 表达阳性率由冻融前的 1 3 . 2 % 1 3 . 6 %增加至2 2 . 3 %士 4 . 4 %, 冻后 1 2 h 达高峰( 3 7 . 9 %士 2 . 5 %) 。冻融V E C与P MN共同孵育后, V E C-P MN粘附 由时照组的0 . 2
3、 0 4 1 0 . 0 2 5 增加至0 . 3 6 3 士 0 . 0 2 2 ( P祠sod Co n tro l 4 1 2 2 4 TNF - a T i m e a f t e r V E C w e r e f r o z e n / t h a w e d 向 F i g . 1 C h a n g e s i n I C A M- 1 e x p r e s s i o n o n t h e s u r f a c e o f t h e V E C a t d i f f e r e n t t i me a f t e r V E C w e r e f r o z e
4、 n / t h a w e d ( .z 1 S , n = 7 ) “尸 0 . 0 1 v s c o n t r o l V E C ; u4尸0 . 0 1 v s V E C a t 4 h a f t e r f r o z e n / t h a we d 中国应用生理学杂志, 2 0 0 6 ; 2 2 ( 2 ) T a b . 1 E f f e c t s o f V E C f r o z e n / t h a w e d o n a d h e s i o n o f V E C t o P MN( x士: ,n=8 ) 凡7 u n m Gr o u p W i
5、 t h o u t I C AM - 1 Ma bW i t h I CAM- 1 Ma b No r ma l VEC+ PMN F r o z e n / Th a we d VE C+P MN TNF - a i n d u c e d VEC+ P M N 0. 2 0 4士0. 0 2 5 0. 3 6 3士0 . 0 2 2 * * 0 . 3 9 7 士0 . 0 2 5 * * “ 0. 1 7 7士0. 0 4 0 0 . 2 7 0 士0 . 0 2 1麟 0 . 2 8 1 士0 . 0 1 2 0 0 * * P 0 . 0 1 v s n o r m a l V E
6、 C + P MN w i t h o u t I C A M - 1 Ma b ; # P 0 . 0 5 , O P 0 . 0 1 v s f r o z e n / t h a w e d V E C + P MN w it h o u t I C A M- 1 M a b ; 0 0 P 0 . 0 1 v s T NF - a i n d u c e d V E C+P MN wi t h o u t I C A M- 1 Ma b 人P MN不影响正常 V E C培养液中L D H活性, 但 2 . 3 冻融和 I C A M- 1 Ma b 对 V E C损伤的影响可使冻融 V
7、 E C培养液中L D H活性增高 5 5 . 1 %( P V E C破坏时, 细胞内乳酸脱氢酶( L D H) 渗漏到0 . 0 1 ) , 提示 P MN参与了冻融所致 V E C损伤。 细胞外, 培养液中 L D H活性高低直接反映 V E C的预先使用 I C A M- 1 Ma b封闭冻融 V E C , 可使冻融 损伤程度。无 P MN存在时, 冻融 V E C培养液中V E C + P MN培养液中L D H活性降低 2 2 . 8 % ( P L D H活性明显高于正常 V E C组, 这是冻结时冰晶0 . 0 1 ) , 与冻融 V E C组无明显差异, 提示 V E C表
8、面 形成及渗透压改变直接造成的V E C物理损伤。加的 I C A M- 1 介导了P MN所致 V E C损伤( 表2 ) 0 T a b . 2 E f f e c t s o f V E C f r o z e n / t h a w e d o n L D H a c t i v i t y in n u t r i e n t s o l u t i o n ( x士: ,n =8 ) L D H a c t i v i t y ( U/ L ) G r o u p W i t h o u t PM NW i t h PM NW i t h PM N a n d I CAM- 1 M
9、 a b No r ma l VE C Fr o z e n / Th a we d VEC 3 1 . 3 7士4. 4 9 1 0 4. 6 4士2 0. 1 4 * * 3 9 . 1 7土5 . 1 4“ 1 6 2 . 3 3 士 2 7 . 8 8群 必 3 3. 8 2士4. 9 5 1 2 5 . 3 9 士2 2 . 2 6 * * P 0 . 0 1 u s t h e g r o u p o f n o r m a l V E C w i t h o u t P MN P 0 . 0 1 u s t h e g r o u p o f n o r m a l V E C
10、w i t h P MN ; 绷尸 0 . 0 1 尸0 . 0 5 u s 3 讨论 冻伤形成包括组织冻结和冻结组织复温融化两 个阶段。组织缓慢冻结过程中形成的冰晶体可造成 细胞损伤, 而且冰晶体形成造成的细胞脱水、 细胞内 高渗透压和p H值改变直接影响细胞内酶活性、 蛋白 质的稳定、 细胞代谢和离子交换等, 直至导致细胞死 亡。本实验中无 P MN存在时, 冻融 V E C培养液中 L D H活性明显增高即冻结造成的V E C直接损伤。 1 9 8 9 年D a s 等川提出冻融损伤类似于I / R损 伤, 活体微循环观察也证实这一观点。目前认为, I / R损伤的起始环节是 V E C
11、和 P MN表面细胞粘附分 子表达增强, 使 V E C - P MN紧密粘附所致。介导 V E C - P MN 紧密粘附的是 V E C表面的 I C A M- 1 , I C A M- 2 和P M N表面的L F A - 1 , M a c - l “ 0 。在体实 验中, 用单克隆抗体封闭C D 1 8 ( L F A - 1 与M a c - 1 共 同的糖蛋白亚基) 可使兔冻足水肿和坏死明显减 轻 1 t 长 体外实验中用单克隆抗体封闭P M N表面 L F A - 1 可减轻V E C损伤 “ , 提示L F A - 1 和M a c - 1 参 与了 V E C冻融损伤。I
12、C A M- 1是 L F A - 1和 Ma c - 1 的相应配体, 推测在冻融过程中一 I C A M- 1表达上调 v s t h e g r o u p o f f r o z e n / t h a w e d V E C w i t h o u t P MN; t h e g r o u p o f f r o z e n / t h a w e d V E C w i t h P MN 并参与V E C损伤。本文证实, 冻融后4 h V E C表面 I C A M- 1 表达明显增强, 冻融后 1 2h和2 4 h I C A M- 1 表达进一步增强, 提示单独冻融这一物理刺
13、激即可 触发V E C表面 I C A M- 1 表达上调, I C A M- 1 表达上 调的机制尚待进一步研究。 本文观察到: V E C冻融后, 冻融V E C与P MN粘 附增强; 预先用 I C A M- 1 Ma b 处理冻融V E C可明显抑 制冻融 V E C与 P MN粘附, 提示冻融 V E C表面 I C A M- 1 表达增多介导了粘附过程。单独冻融 V E C时 P MN未受冻融刺激, 可排除冻融导致 P MN表面 L F A - 1 表达增强的可能。冻融 V E C与 P MN粘附增 强可能是V E C表面I C A M - 1 表达增强所致, 尚不能排 除I C
14、A M- 1 表达增强诱导P MN表面 L F A - 1 表达上调 的可能, 即配体和受体之间可能存在相互诱导作用。 许多实验证实 P MN参与了冻融损伤。E i s e m a n 对经氮芥处理出现白细胞减少症的白兔作冷冻处 理, 其组织丢失由对照组的7 1 %减少至4 0 。本实 验证实, P MN不损伤正常 V E C , 但明显加重冻融 V E C损伤, 即P MN参与了冻融所致 V E C损伤。预 先用 I C A M- 1 Ma b 处理冻融 V E C可明显减轻 P MN 引起的 V E C损伤, 表明 I C A M- 1 介导了P MN所致 1 5 6C h i n J A
15、 p p l P h y s i o l 2 0 0 6 ; 2 2 ( 2 ) 一一Jlesesl 、U 厂.r.L 一一Jlesesl 0乃n, r.LrL V E C损伤, 阻断 V E C - P MN粘附即可减轻 V E C损 伤。这与秋水仙碱不能阻断 P MN - V E C粘附, 因而 不能减少受冻兔耳组织丢失是一致的。I C A M- 1 Ma b 减轻 V E C损伤的机制可能是阻断 V E C - P MN 粘附, 抑制粘附后 V E C内过氧化物水平增高, 从而 减轻 V E C损伤。 综上所述, 冻融可上调 V E C表面I C A M- 1 表达, 进而促进V E C
16、 - P MN粘附, 导致 V E C损伤。I C A M- 1 Ma b通过封闭 V E C表面的 I C A M- 1 , 阻断 V E C - P MN粘附, 减轻 V E C损伤, 即 I C A M- 1在 V E C冻 融损伤中起重要作用。使用 I C A M- 1 Ma b干预 I C A M- 1 介导的 V E C - P MN粘附有可能成为冻融损 伤治疗的新靶点。 7 4 参考文献 1 0 1 1D a s D K, S a m a n t a S , R u s s e l l J C e t a l .R e d u c t i o n o f c o l d i n
17、j u r y b y s u p e r o x i d e d i s m u t a s e a n d c a t a l a s e R . AD A 2 1 3 7 5 7 , 1 9 8 9 . 赵克森 . 主编. 微循环进展 M . 成都:电子科技大 学出版社, 1 9 9 1 . 8 0 - 8 9 . 刘嘉壕. 氧自由基在冻伤发病中的作用 J 1 . 解放军 预防医学杂志, 1 9 9 8 , 1 6 ( 6 ) : 4 6 6 - 4 6 8 . Ma r z e l l a L, J e s u d a s s R R, Ma n s o n P N, e t a l
18、. Mo r p h o - l o g i c c h a r a c t e r i z a t i o n o f a c u t e i n j u r y t o v a s c u l a r e n d o t h e - l i u m o f s k i n a f t e r f r o s t b i t e J .P l a s t R e c o n s t r S u r g , 1 9 8 9 , 8 3 ( 1 ) : 6 7 - 7 5 . C a r l e s T M, H a r l a n J M. L e u k o c y t e - e n d
19、o t h e l i a l a d h e - s io n m o l e c u l e s J . B l o o d , 1 9 9 4 , 4 : 2 0 6 8 - 2 1 0 1 王敏, 刘嘉流, 杨增仁, 等. 淋巴细胞功能相关抗 原一 1 在冻融 P MN介导的 V E C损伤中的作用【 J .中 国应用生理学杂志, 2 0 0 3 , 1 9 ( 1 ) : 5 2 - 5 5 . T a m a t a n i T, K o t a n i M, Mi y a s a k a M, e t a l . C h a r a c t e r - i z a t io n
20、o f t h e r a t l e u k o c y t e i n t e g r i n , C D 1 1 / C D 1 8 , b y t h e u s e o f L F A - 1 s u b u n i t - s p e c i f i c m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s J . E a r J I m m u n o l , 1 9 9 1 , 2 1 : 6 2 7 - 6 3 3 . 颜培华, 李凤芝. 大鼠主动脉内皮细胞培养及鉴定方 法 J . 军事医学科学院院刊, 1 9 9 3 , 1 7 ( 2 ) : 1
21、 2 4 - 1 2 5 . 颜培华, 李凤芝, 刘嘉流, 等. 血管内皮细胞冷损伤 模型的建立【 J . 解放军预防医学杂志, 2 0 0 5 , 2 3 ( 2 ) : 1 0 3 - 1 0 4. V a i n e r B , N i e l s e n O H, H o rn T. C o m p a r a t i v e s t u d i e s o f t h e c o l o n i c i n s i t u e x p r e s s io n o f i n t e r c e l l u l a r a d h e s io n m o l e c u l e s
22、 ( I C A M- 1 , - 2 , - 3 ) , b e t a 2 i n t e g r i n s ( L F A - 1 , Ma c - 1 a n d p 1 5 0 , 9 5 ) , a n d P E C A M- 1 i n u l c e r a t i v e c o l i t i s a n d c o r h n s d i s e a s e J . A m J S u r g P a t h o l , 2 0 0 0 , 2 4 ( 8 ) : 1 1 5 - 1 2 4 . Mi l e s k i W J , R a y m o n d J F
23、 , Wi n n R K, e t a l . I n h ib i - t i o n o f l e u k o c y t e a d h e r e n c e a n d a g g r e g a t i o n f o r t r e a t m e n t o f s e v e r e c o ld i n j u r y i n r a b b i t s J .J A p p l P h y s i o l , 1 9 9 3 , 7 4 ( 3 ) :1 4 3 2 - 1 4 3 6 . llj 一一J,esesJ,eses一 2门J4 rLFL一esesL ROL
24、E OF CELLULAR ADHES I ON MOLECULE I CAM- 1 I N F R E E Z I NG/ T HAWI NG I N J URY OF V A S C UL A R ENDOTHELI AL CELLS L I U J i a - y i n g , S H A N Q i u - Z i n g , Y A N G Z e n g - r e n , Y A N P e i - h u a , S U N F a n g - r e n ( I n s t i t u t e o f H e a l t h a n d E n v i r o n m e
25、n t a l Me d i c i n e , A c a d e m y o f Mi l i t a r y Me d i c a l S c i e n c e s , T i a n j i n 3 0 0 0 5 0 , C h i n a ) ABS TRACT A i m: T o i n v e s t i g a t e t h e r o l e o f 1 C MA - 1 o n t h e s u r f a c e o f v a s c u l a r e n d o t h e l i a l c e l l ( V E C ) i n f r e e z i
26、 n g / t h a w i n g i n j u r y o f V E C , i n o r d e r t o e l u c i d a t e t h e p a t h o g e n e s i s o f f r e e z i n g / t h a w i n g i n j u r y . Me t h o d s : V E C s e p a r a t e d a n d c u l t u r e d f r o m r a t a o r t a a n d P MN s e p a - r a t e d f r o m r a t p e r i p
27、 h e r a l b l o o d w e r e s e l e c t e d a s e x p e r i m e n t m a t e r ia l s . T h e f r o z e n / t h a w e d V E C m o d e l w a s f o u n d e d b y f r e e z i n g V E C w i t h t h e t y p e WK L - V r a t e c o o l i n g i n s t rum e n t a n d t h e n r e w a r m i n g t h e m i n a w
28、 a t e r b a t h . I C A M- I e x p r e s s io n o n t h e s u r f a c e o f f r o z e n / t h a w e d V E C w a s d e t e c t e d a t 4 , 1 2 a n d 2 4 h a f t e r f r e e z i n g / t h a w i n g w i t h i m m u n o h i s t o c h e m i c a l m e t h o d . A f t e r c o i n c u b a t i n g f r o z e
29、 n / t h a w e d V E C w i t h n o r ma l P MN, t h e a d h e s i o n o f V E C t o P MN w a s m o n i t o r e d w i t h r o s e b e n g a l s t a i n i n g a s s a y a n d t h e i n j u r y l e v e l o f V E C w a s i n d i c a t e d b y me a s u r i n g L D H a c t i v i t y i n n u t r i e n t s
30、o l u t i o n . R e s u l t s : T h e I C A M- 1 e x p r e s s io n o n t h e s u r f a c e o f V E C i n c r e a s e d f r o m 1 3 . 2 %士3 . 6 % b e f o r e f r e e z i n g / t h a w i n g o f V E C t o 2 2 . 3 %士4 . 4 % a t 4 h o u r a f t e r f r e e z i n g / t h a w i n g , a n d r e a c h e d
31、t h e p e a k ( 3 7 . 9 % 1 2 . 5 %) a t 1 2 h o u r a f t e r f r e e z i n g / t h a w i n g o f V E C . A f t e r c o i n c u b a t i o n o f f r o z e n / t h a w e d V E C w i t h n o r m a l P MN, t h e a d h e r e n c e o f f r o z e n / t h a w e d V E C t o P MN i n c r e a s e d f r o m g
32、r o u p c o n t r o l 0 . 2 0 4 1 0 . 0 2 5 t o 0 . 3 6 3 土 0 . 0 2 2 ( P 0 . 0 1 ) , L D H a c t i v i t y i n n u t r i e n t s o l u t io n i n c r e a s e d f r o m g r o u p c o n t r o l 1 0 4 . 6 4 士 2 0 . 1 4 U/ L t o 1 6 2 . 3 3 1 2 7 . 8 8 U / L( P0 . 0 1 ) , m o n o c l o n a l a n t i b
33、o d y a - g a i n s t I C A M- 1 ( I C A M- 1 Ma b ) c o u l d p a r t i a l l y b l o c k t h e a d h e r e n c e o f f r o z e n / t h a w e d V E C t o P MN ( 0 . 2 7 0 1 0 . 0 2 1 , P0 . 0 1 ) , a n d d i m i n i s h L D H a c t i v i t y i n n u t r i e n t s o l u t i o n ( 1 2 5 . 3 9 士 2 2 .
34、 2 6 U/ L , P0 . 0 5 ) . C o n c l u s i o n : T h e f r e e z i n g / t h a w i n g o f V E C c a n e l i c i t e a n i n c r e a s e i n I C A M- 1 e x p r e s s io n o n t h e s u r f a c e o f V E C, a n d t h e n p r o c e e d t o V E C - P MN a d h e r e n c e a n d l e a d t o V E C i n j u r
35、 y . 中国应用生理学杂志, 2 0 0 6 ; 2 2 ( 2 )1 5 7 K E YWO R D S : i n t e r c e l l u l a r a d h e s i o n m o l e c u l e - 1 ( 1 C A M- 1 ) ; i n j u r y ; i s c h e m i a / r e p e r f u s i o n ( I / R ) v a s c u l a r e n d o t h e l i a l c e l ls ( V E C ) ; n e u t r o p h il ( P MN ) ; f r e e z i
36、 n g / t h a w i n g 不同性别及性腺功能对梭曼引起大鼠低温的影响 杨永录 , 景志敏 3 , 李雨珊2 , 杨镇2 ( 1 . 成都医学院病理生理教研室, 四川 成都 6 1 0 0 8 1 ; 2 . 兰州大学八一学院, 兰州 7 3 0 0 2 0 ; 3 . 西北民族大学医学院, 甘肃 兰州 7 3 0 0 3 0 ) 摘要目的: 研究不同性别及性腺功能对梭曼引起大鼠低温的影响。方法: 用数字体温计测量大鼠的结肠温度, 观察梭曼引起 正常雄性和雌性大鼠低温反应的性别差异以及切除性腺后对其作用的影响。结果: 雌性大鼠对梭受引起的低温反应比雄鼠更 敏感。切除雄性大鼠辛丸后
37、能明显提高对梭曼低温反应的敏感性, 而切除卵集的雌性大鼠对梭曼的低温反应与模拟手术组无 明显差异。结论: 雄性和雌性大鼠对梭曼敏感性的性别差异主要取决于辛丸的功能。 关键词: 校曼; 低温; 性别差异 K E Y WO R D S : s o m a n ; h y p o t h e r m i a ; s e x u a l d i f f e r e n c e s 中文分类号: R 3 6 4 . 6文献标识码: A文章编号: 1 0 0 0 - 6 8 3 4 ( 2 0 0 6 ) 0 2 - 0 1 5 7 - 2 化学战剂梭曼是一种强烈不可逆的胆碱醋酶( A c h E ) 抑
38、 制剂, 可导致机体稳态系统明显紊乱, 严重时可引起死亡。 近年来研究发现, 亚致死剂量梭曼的毒性作用之一, 可引起 啮齿类动物体温快速的降低川。但有机磷毒剂对动物的毒 性效应有性别差异 2 , 其机理研究的不多。 所以 本研究观察 了梭曼引起雄性和雌性大鼠低温反应的性别差异以及切除 性腺后对其作用的影响。 1 材料与方法 1 . 1 动物和试剂 实验用成年雄性和雌性 Wi s t a r 大鼠( 兰州军区总医院实 验动物中心提供) , 体重1 9 0 - - 2 4 0 8 , 分别单笼饲养于2 2 环 境中, 明暗时间各为 1 2 h , 允许动物自由进食进水。梭曼的 纯度大于 9 8 %
39、, 用无菌生理盐水溶解。 1 . 2 动物手术 用 5 %戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉( 5 0 m g / k g ) 动物, 按照常规手术方法切除雄性大鼠的攀丸和雌性大鼠的卵巢, 对照组动物进行模拟手术, 每只动物完成手术后立即肌肉注 射青霉素以防感染。根据文献报道, 性腺切除动物应饲养5 0 d 后进行实验l 3 1 . 3 体温测f 用WM S-1 2 1 智能化高精度数字体温仪( 分辨率为 0 . O 1 C, 准确度为1 0 . 0 5 9 0, 上海医用仪表厂生产) 测量大鼠结 肠温度, 体温探头插入结肠 6 c m深, 每次测温间隔 6 0 m i n . 给药前3 h 开始测量
40、体温, 取3 个数据点作为基线体温, 即为 给药前的对照值。给药后 1h开始测量体温, 至少要测量 7 次, 即观察 7h以上。 体温反应指标用平均体温反应曲线和体温反应最大幅 度与基线体温之间的差( DT ) 表示。 1 . 4 实验分组与步骤 1 . 4 . 1 梭曼对正常雄性和雌性大鼠低温效应的观察雄 性和雌性大鼠各分2 组, 每组7 只。对照组: 生理盐水 1 m 1 / k g ; 梭曼组: 梭曼6 0 t cg / k g ( 6 0 t eg / m l 生理盐水) 。在实验前 一天下午将动物移到实验室, 分别单个置于鼠笼中, 让动物 在实验室安静过夜, 随意进食进水。上午 8时
41、开始测量结肠 温度, n时皮下注射梭曼或生理盐水。 1 . 4 . 2 切除性腺对梭曼引起雄性和雌性大鼠降温作用的观察 雄性和雌性大鼠各分4 组( 每组7 只) , 即模拟手术一 生理盐水 组、 性腺切除一 生理盐水组、 模拟手术一 梭曼组和性腺切除一 梭曼 组。性腺切除和模拟手术大鼠给药时间、 剂量和测温方法同上。 1 . 5 数据处理 实验数据用均数士 标准差( x士: ) 表示, 采用 t 检验进行 统计分析。 2 结果 2. 1 A 梭曼引起正常雄性和雌性大鼠降温作用的差异 二 ”加打加肠 0。巴日.eduJ三。一uoloo 3 4 言一 1亨一寸一寸一 5言- 一宁 一猫一嘴一一 扁 0。ejn利巴odE。1劝 F i g . 1 D i f f e r e n c e o f h y p o t h e r m i a i n d u c e d b y s o m a n b e - t w e e n m a l e a n d f e m a l e r a t s ( n =7 ) 祷 尸 0 . 0 5 , - P0 . 0 1 v s c o n t r o l g r o u p ; # 尸 0 . 0 1 u s ma l e g r o u p
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